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标题:【求助】请教有经验的老师： 我的蛋白下步该如何纯化阿？

any333[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教有经验的老师： 我的蛋白下步该如何纯化阿？

各位老师好，我是一个刚下科室的研究生 。我的蛋白表达出来是一个包涵体，想纯化出来制备单克隆抗体，来检测真核细胞中这一段的表达情况。
pI=9.775
氨基酸组成：
Amino acid Number
Ala(A): 16
Cys(C): 3 Asp(D): 12 Glu(E):21 Phe(F): 12 Gly(G): 17
His(H): 13 IleMy heart: 18 Lys(K): 19 Leu(L):30 Met(M): 5
Asn(N): 14 Pro(P):22 Gln(Q): 10 Arg(R): 22
Ser(S): 33 Thr(T): 23 Val(V): 17
Trp(W):8 Tyr(Y): 5 Total : 320
我用2M和4M尿素洗涤包涵体后，用8M尿素溶解后上了一个sp fast flow 柱，
starting buffer: 8M urea 20mMtris-cl pH 8.7
elution buffer: 8M urea 20mMtris-cl 0.5MNaCl pH 8.7 分布洗脱在20%elution buffer时得峰一，40%elution buffer时得峰二。
在峰二中得到了的蛋白中有与目的蛋白很接近的杂带，我现在不知怎么办好
我的蛋白是带his标签的,以前我也曾在sp 后用chelating HP纯化过，但怎么都去不掉那根杂带，请教各位老师我现在该怎么办？ 谢谢各位了
另附上 我sp纯化后的SDS PAGE 电泳图
1 诱导的蛋白
2 上样前sample
3 流窜峰
4 峰一
5 峰二
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，如果我是你，我就先用Qiagen的Ni－NTA来纯化，这种亲和层析是效率最高的，你试试看用不同浓度的咪唑来洗涤，能否把那条带洗涤掉。
然后再用阴阳离子柱来纯化，效果会更好。
由于你的蛋白有一个free的cys，所以你要充分的还原！！
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any333[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的老师。
由于科里实验条件的限制，我们只有amersham 的 chelating fast flow 填料，不知这种填料可以么?
另外，如果先上亲合柱buffer里加NaCl么 我看好多都是加了的，那如果加了NaCl后面的离子柱有没有影响，该如何设计离子柱的buffer？
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glass[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

改用不同浓度的咪唑做阶段洗脱.同时留意样品处理,要越新鲜的菌体越好,看有没有差别,此外可以优化,好多这样的讨论,搜索看看吧.
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发表于 2014-5-31 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为Ni－NTA在实用中并没有比IDA好多少，amersham 的 chelating fast flow 足够用了。
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

改用不同浓度的咪唑做阶段洗脱.同时留意样品处理,要越新鲜的菌体越好,看有没有差别,此外可以优化,好多这样的讨论,搜索看看吧.
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制填料如煮小鲜 cuturl('www.wsac.cn')
想请教一下，采用Ni柱纯化的样品大概要几个his才容易挂柱，另外为什么要新鲜的样品，这个对挂柱有影响吗，谢谢
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再想请教一下，如果有free cys，那么应该是在什么时候加还原剂，8M尿素变性得时候需要加吗，谢谢
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
顺便问一下，Ni柱只和his结合吗，和cys可以结合吗，谢谢
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小游abc 于 2014-5-31 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

改用不同浓度的咪唑做阶段洗脱.同时留意样品处理,要越新鲜的菌体越好,看有没有差别,此外可以优化,好多这样的讨论,搜索看看吧.
--------------------------------------------------------------------------------
...

其实通常6个his足够了,新鲜可以避免降解等原因导致杂带难分离.
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小游abc[使用道具]
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 小中大
我得蛋白表达出来是包含体，不带有histag，里面含有4个his，我尝试用Ni柱变性条件下上样，咪唑洗脱，做了两次可以得到比较纯的蛋白，但是接下来的几次实验条件都没有变，但是就是没有洗脱峰，都快要急疯了，这是什么原因，谢谢
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