【求助】请教高手酵母表达上清浓缩方法

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标题:【求助】请教高手酵母表达上清浓缩方法

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发表于 2014-5-31 09:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问：在做酵母表达时，浓缩上清后跑蛋白电泳一般用什么办法呢，跑了电泳后做WESTTING blot ，我浓缩了很久方法都不是很稳定，有时有条带有时没。谢谢！

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发表于 2014-5-31 09:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2014-5-31 09:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

似乎上清直接电泳也应该有条带了啊，不然表达量很低。浓缩一般都是硫酸铵沉淀、超滤，有条件的话冷冻干燥或者真空抽干。硫酸铵沉淀小心地完全吸去液体再重新溶解，可以不透析直接上样。超滤和冻干都需要仪器

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发表于 2014-5-31 09:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你们！请问：饱和硫酸铵是怎么配制的呢？直接在装热水的容器中用烧杯边加边搅拌直到不能溶解吗？另外你饱和硫酸铵加多少到多少上清中呢？加了后在4度还是常温放置呢，放多久呢？
请问“petrelj”：我真空冷冻抽过两次，抽干后再加缓冲液溶解，但它可能是培养基里面的盐太多了，跑电泳跑不怎么动，跑了后不怎么看得到条带，请问你是抽干再跑吗？抽干后加什么溶解的呢》？谢谢！

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发表于 2014-5-31 09:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外硫酸铵沉淀后用于做westing blot ，需不需要怎么处理去掉硫酸铵呢？

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发表于 2014-5-31 09:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我浓缩上清的办法：
1. 900ul上清＋100ul 100% TCA，冰浴30min；
2.最大速度离心 30min；
3.以冷丙酮洗涤沉淀两次；
4.风干丙酮，加入1Xloading buffer悬浮，电泳。

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发表于 2014-5-31 09:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用冷丙酮沉淀的方法沉淀过夜,离心后抽干,沉淀加PB溶解.不过有时加步G25脱盐电泳效果很好.

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发表于 2014-5-31 10:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问:你离心用多大速度呢，是常温下离吗？100%TCA的配法就是100克加到100毫升水中吗？这种方法处理后蛋白用于后面做westing blot 可以吗，有没有什么影响呢？谢谢！

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发表于 2014-5-31 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用丙酮沉淀是多少毫升上清加多少毫升丙酮呢？是常温下离心吗？离长时间呢？“加步G25脱盐”是什么东西呢？可不可以提供一个你的具体步骤给我呢，谢谢！

daod[使用道具]
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发表于 2014-5-31 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 987789 于 2014-5-31 10:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问:你离心用多大速度呢，是常温下离吗？100%TCA的配法就是100克加到100毫升水中吗？这种方法处理后蛋白用于后面做westing blot 可以吗，有没有什么影响呢？谢谢！ ...

12000rpm离心30min。100%TCA是现配TCA，然後加水补平到100%(M/V).

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