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标题:【求助】细胞培养上清中蛋白怎么纯化？

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细胞培养上清中蛋白怎么纯化？


请问那位大侠知道将细胞分泌到培养上清中的蛋白纯化出来的方法？注：分泌量较高，无相应抗体等的一般蛋白。急用！！！谢谢！
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发表于 2014-5-31 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先你要了解目标蛋白的性质，才有可能确定纯化方案。培养上清是有血清还是无血清的，无血清的要好纯化很多。培养上清中一般都会有大量的色素和核酸，所以第一步优先考虑阳离子柱层析，这部既可以让色素和核酸穿柱而除去，又起到浓缩作用，蛋白浓度提高后可以考虑用硫酸铵沉淀。接下来可以来个阴离子柱层析，最后一般还过一步分子筛，换换缓冲液之类的。具体提纯到什么程度就看你的需要了
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵！好象有点问题哦！培养基的成分那么的复杂，我觉得应该首先用超滤进行换液，消除培养基成分对纯化带来的影响．然后才能根据你的目的蛋白的性质来决定用什么纯化方法．换液这一步是很重要的
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发表于 2014-5-31 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是有血清培养，第一步过阳离子柱主要除去牛血清白蛋白，然后过一步疏水试试，最后考虑分子筛。
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xiaoxiaoniao 于 2014-5-31 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
呵呵！好象有点问题哦！培养基的成分那么的复杂，我觉得应该首先用超滤进行换液，消除培养基成分对纯化带来的影响．然后才能根据你的目的蛋白的性质来决定用什么纯化方法．换液这一步是很重要的 ...

如果表达量低，可以考虑UF浓缩。但一般来说把culture完全换掉的比较少，除非有特别苛刻的capture条件。
硫酸铵沉淀分辨率有限，而且再上IEX还需要稀释，因此一定规模的纯化不常用。
IEX-HIC结合使用是比较好的选择，衔接也容易。
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发表于 2014-5-31 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在IEX和HIC之间加一步硫酸铵沉淀我还是比较推荐的，然后在根据效果决定取舍，我就做过一种蛋白，少了这部就永远达不到98%。
纯化是没有绝对的，一切结果说了算！
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发表于 2014-5-31 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那就需要搞清楚只有硫酸铵沉淀才能去除的杂质到底是什么，性质如何。
为什么其他步骤没有成功的去掉，能不能排除有相互作用？
需要有针对性的去除这种杂质，不能只看目的蛋白。
还有，你的纯度检测方法是什么？
HPLC纯度>99%，也不一定质量就是合格的，还要对可能残留的杂质进行分析，如HCP, host DNA, leached ligand, Endotoxin,etc。
多数情况下，若没有成功去除，往往是个优化的问题，是否所有的变量都考虑进去了呢。
如果一定要加盐析，也建议在HIC前，不要在IEX前。
yangyufeng战友不妨说说您的那种特殊蛋白是什么？用什么表达的？培养条件如何？那种和目的蛋白性质及其相似的杂质是什么？
我相信，一定不会只有盐析这一种方法，查查文献就知道了
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
所以第一步优先考虑阳离子柱层析，这部既可以让色素和核酸穿柱而除去，又起到浓缩作用，蛋白浓度提高后可以考虑用硫酸铵沉淀。

========================================================================

其实，CIEX的作用并不止这些，要不，直接硫酸铵沉淀不是也可以浓缩并且去除色素/核酸吗？
另外，核酸和碱性蛋白如果有相互作用，sp可能是去不掉的。
硫酸铵沉淀的缺点在于不好控制，重复性差，纯化分辨率低，不容易放大，收率不高；
但也有它的优点，成本低，尤其纯化小量蛋白还是可以考虑的。
当然，什么都不是绝对的，具体情况需要具体分析。
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发表于 2014-5-31 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞分泌到培养上清中的蛋白含量一般比较低，而上清的量又比较大，所以第一步用硫酸铵沉淀并不明智，（当然xukaibiao的情况可以考虑沉一下）IEX之后目标蛋白得以浓缩，使硫酸铵沉淀沉淀成为可能，更特殊的是我做那个蛋白（一种白介素）溶解性特好，没沉下来，倒把杂蛋白给沉了一些，所以离心后直接上HIC，衔接自然，结果很令人满意！
至于杂质到底是什么，性质如何，还没探究。
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吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢各位大虾的关照！
我们也考虑到血清培养基中的成分影响,所以想用无血清培养基培养,不过具体的方法还不清楚,包括培养基的选择、中间的具体操作等，我们看到有的文章是说先用含血清培养基培养然后逐步换成无血清的，不知道这种做法怎么样？
另外，蛋白结晶能不能用？
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