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标题:【求助】我的蛋白先表达,重新转BL21后又不表达了

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发表于 2014-5-31 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的蛋白先表达,重新转BL21后又不表达了


我的蛋白先表达了一次,但是当时忘了保菌或是原始菌丢失了,没办法,只好重新转BL21.但我用同一质粒,同一批BL21,转了两次,每次挑9个菌,跑PAGE发现,都没有表达,不知道是怎么回事?哪位大侠指点一下,感激涕零!!!!!!
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发表于 2014-5-31 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

IPTG有没有出问题？
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 小中大

应该没有吧,我都是用的同一批配的IPTG,没有另外重新单独配.
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发表于 2014-5-31 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1看质粒降解了没有
2有些质粒存在这种问题，主要见于保菌时间长的情况。你可以换培养基试试。
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发表于 2014-5-31 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

已经考虑了"山百合"战友所提到的因素,前天重新做的酶切,昨天跑胶发现载体带和目的片段带都很清晰,并没有发现质粒丢失的情况.今天已经重新做了转化,准备重新挑菌再诱导,还不知结果会怎样!


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发表于 2014-5-31 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同情你老兄，我也是遇到类似问题，怎么都不再表达了，现在只好重新按照原来路线构建，还不知道会怎样呢
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发表于 2014-5-31 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

奇怪的现象我也碰到过，绞尽脑汁也想不通是什么原因。
如果重新做，建议换载体或宿主菌。
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sistis[使用道具]
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发表于 2014-5-31 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老兄,"换载体"说得容易啊,我前面从做RT-PCR拿到基因到连T载体只用了2个星期,而连T4亚克隆到表达载体足足做了快2个月,好不容易终于鉴定成功了,现在又表达不出来,要是现在换载体,等于先前的工作就白做了,搁谁谁不心疼啊???
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