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标题:【求助】相当的郁闷，pet28a/BL21(DE3)系统不表达

尘朵朵[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】相当的郁闷，pet28a/BL21(DE3)系统不表达


同时表达了几个片段，小的有666bp,大的有2643bp，表达线路是先将片段和载体双酶切连接后转到DH5a里，再从DH5a里提质粒转到表达宿主菌BL21(DE3),几个大片段的阳性也是转了好几次才挑出来，指望最后一步一起诱导大丰收的，结果IPTG诱导后六个片段一个都没有表达（做了阴性对照），相当的郁闷，几天的熬夜到最后一步却是如此结果，谁能告诉我为什么。我到底错在哪里啊？（仰天长叹状）
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，做大肠杆菌原核表达时，须要注意一点的就是所表达的外源蛋白对宿主本身没有毒性，否则会被宿主产生相应的蛋白酶降解。此外，在诱导表达之前，要确保你构建的表达框架是否正确，这一点很重要，直接关系到你所做的一切。另外，如果有毒性，看是否由于稀有密码子的原因，导致表达量过低，无法检测到或是由于形成包涵体，没有正确的检测方法而认为实验失败。上述因素请加以考虑，祝你实验顺利！
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
我也是这样。正在为这事头疼。
我跑了几次胶，都没有明显的表达。
而且找不出什么原因。
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u76mp[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的情况与楼主 一样.只是 我以前做过几个测序错误的质粒,表达的多不错,可是一旦连上正确的序列却不表达.为这个事我愁 啊!这 是否真的意味 着楼上所说的所表达的外源蛋白对宿主本身没有毒性???
请高手指点.
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发表于 2014-5-31 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是同时做了六个片段的表达，有些是正向引物一样，反向引物不一样，有些是反向引物一样，正向引物不一样，检查了可能的双酶切位点搞反以及移码的情况，表达框应该没有问题，现在最担心的就是gxumxc所说的稀有密码子的原因，以前做原核表达用的是pet32a/Rosetta-gami(DE3),一直都没有考虑稀有密码子的问题，实验室也没有人做过pet28a/BL21(DE3)的表达，万一真的是稀有密码子的问题，我该怎么做？还有挽救的余地吗？
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发表于 2014-5-31 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚刚查了些资料，发现要表达的序列有比较多的连续的稀有密码子，而表达宿主菌BL21(DE3)没有Rosetta-gami(DE3)那样可以提供稀有密码子tRNAs,所以现在初步怀疑是由于这个原因造成的不表达，觉得现在我好像有两个选择，一是更换载体和宿主菌，用比较稳定的pet32a/Rosetta-gami(DE3)来重新表达；二是不换载体，换一种可以表达稀有密码子的宿主菌如Rosetta-gami(DE3)，但是pet28a是kan抗性，Rosetta-gami(DE3)含有tet,kan,cam抗性，没有抗性标记，可不可以在pet28a载体上加一个amp的抗性，或者消除掉Rosetta-gami(DE3)的kan抗性标记？有没有人做过相关的这样的工作，能不能给点建议？等待结果中。。。
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发表于 2014-5-31 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上是为了让表达的蛋白可溶性更好，不一定能解决你的问题。ROSSETTA你可以试一下。我碰到过类似的情况。没有作用。毕竟影响表达的因素太多了。有许多情况不是转录的问题，而是翻译和翻译后的问题，和氨基酸序列也有关系。
强烈建议你仔细研究一下培养条件和诱导条件，有时候条件不同有着天壤之别。
或做融合表达，比如用pET32a，与TrxA蛋白融合，或者GST融合，一般单独难表达的融和后都能有一定程度的表达。
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发表于 2014-5-31 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有同样的问题，同时作了2个克隆，载体是pET30a，一个表达，一个不表达。
同意楼上的建议，因为我还表达了另外几个蛋白，载体是pMalc－2x，37度不表达，在30度就表达了。其他因素还有IPTG，我用1mM.
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尘朵朵[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上你好，我已经做了培养条件的优化摸索，做了28度和37度的比较，同时IPTG的浓度也做了从0.05，0.5，1，5mm的比较，还是没有表达，不过我在加入IPTG时没有更换新鲜培养基，不知道这有没有影响。我现在猜测如你所说的那样，是因为单独难表达的缘故，所以现在正在更换载体和表达宿主菌，用pet32a/Rosetta-gammi(DE3)与TrxA蛋白融合表达。希望这一次能够出来，再不出来的话真要跳楼了。
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am10[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有文章说，可能是质粒丢掉了，使用200ug/ml的AMP养菌。
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