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标题:【求助】关于裂解液等

lixi559[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于裂解液等

我是新手，不知道应该如何选择裂解液，不知道各位初做WB时是否也有这样的问题。文献上裂解液的配方也有很多，加不加蛋白酶抑制剂呢？这个东东好象很贵的，请问大家成品的裂解液一般在哪买的？另外：70KD的蛋白用10%的胶跑是否合适呢？多谢了
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发表于 2014-5-31 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
文献上说是要加的，但我做的时候
手头没有也继续做下去了。纯化后
的蛋白放到4度冰箱，一周后也没有
发现降解。不过师兄说最好在裂解
时加上化学抑制剂PMSF,可以免去蛋白
酶对自己目的蛋白的影响（虽然影响小）。
70kd的蛋白用10%的胶跑是合适的，
我的75kd的蛋白用12%的跑的条带要比10%的清晰。
你也可以摸索一下。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你裂解液的配方用的是哪种呢？这跟目的蛋白以及细胞种类有关系吗？
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该没关系的 ， 再说PMSF也不贵。
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发表于 2014-5-31 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般用磷酸盐缓冲液作为裂解液的母液。
一般情况下，只要裂解液有足够的缓冲能力
就可以了。当然也与你下一步如何处理蛋白有关。
比如下一步你要过Ni柱，那就用过柱时所用缓冲液
为母液，再添加溶菌酶，DNA酶等物质用于裂解。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用的是酶溶法吧?你裂解的是细菌吗?
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发表于 2014-5-31 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2014-5-31 15:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用的是酶溶法吧?你裂解的是细菌吗?

我用的是超声法裂解的BL-21。
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发表于 2014-5-31 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胞浆蛋白和核蛋白的裂解液比较多，自己配的提的也不错；pierce的挺方便的，常温5分钟就能提了。
如果提膜蛋白就比较麻烦，自己配的试剂到现在都提不出来，要不就浓度太低；pierce的膜蛋白提取又太贵了
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你配的裂解液有没有加 Aprotinin, Leupeptin 等蛋白酶抑制剂等呢？
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-5-31 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一次没有加，好像也没什么影响；以后都加了aprotinin和PMSF。
因为用量很少，所以感觉也不是很贵。
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