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标题:【求助】有关PET30a表达载体的问题

qqq111[使用道具]
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发表于 2014-6-4 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关PET30a表达载体的问题


我最近要使用PET30a载体做蛋白表达，所选上游的酶切位点是BAMH I，下游是 Hind III,这样的话就等于最后的融合蛋白有两个HIS标签，而且在N端的载体融合序列较长，我的问题是N端的载体融合氨基酸序列太长对我的目的蛋白是否有影响？如果用蛋白酶切的话，有没操作方法可以介绍一下？使用两个His标签与单独使用一个标签有什么区别？请您帮忙解答！谢谢!
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发表于 2014-6-4 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在手头没有图，大概记得PET30a的his是前端融合比较好用，但是我和我师姐用这个载体表达不同的蛋白都没有能够纯化出蛋白来。我的是一直在沉淀中，师姐的就根本没有诱导出来。
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发表于 2014-6-4 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

N端的载体融合氨基酸序列应该对目的蛋白结构影响不会有太大影响。但是否需要取决于你表达蛋白的目的。两个标签获得纯化的可能性应该更大。
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发表于 2014-6-4 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么不用nde1和xhol，那你根本就不用考虑影不影响结构的问题。
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发表于 2014-6-4 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


刚看了一下质粒图谱,如果你上游选择是BamH I, N端就要多表达His tag---thrombin-----S tag-----enterokinase-------,加起来差不多有50个AA了,很难保证说不影响你的蛋白活性,具体要看蛋白的空间构象及大小了.
我觉得你如果非要选择这个质粒,同意erwinchen站友的意见,克隆可能相对要难些,但都已有文献报道C端可纯化出蛋白,为什么不这么做呢,按你说的方案,N及C端都多表达了很多序列,即使纯化出蛋白,也极可能影响活性.N端用Nde I的最大好处是CATATG不用多表达AA,
如果有别的质粒的话,28a 和32a可能是更好的选择,克隆选择相对容易.
两端都融合有纯化标签的话,如果是两个不同的标签,好处就是通过两步不同的亲和层析可以得到高纯度的全长蛋白(文献上有报道的pALEX纽约大学的),但如果是同一个纯化标签就完全没有必要了.
例如 GST-----protein------HIS 过一次GST亲和层析+镍柱,即可获得完整的全长蛋白.
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发表于 2014-6-4 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用Nde1贵啊朋友，而且活性一般，xhol好像也不大好用，我已经看到用c端标签纯化出蛋白的文章了。。。
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发表于 2014-6-4 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

手头上只有PET30a表达载体，跟文献上表达的蛋白不同，但用途相似，都是作为血清学检测用的抗原，C端标签相对简单就一个HIS标签，融合aa也短，我就用上游NDE1，下游选个HIND111,这个方案应该可行吧。
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发表于 2014-6-4 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可行啊，rbs接下来就是Nde I，注意阅读框对好．
另外Nde I是个ＡＴ的粘端，不象别的限制酶粘端结合力那么强，相对难酶连一些，可考虑平末端酶连体系．
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发表于 2014-6-4 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用NdeI绝对是最佳选择，理由是它不会给你的蛋白带入融合序列，以免影响活性，二是它以ATG结束，不必考虑移码的问题．
如果万一你的目的基因有NdeI位点，如果不想引入融合序列，可考虑这样操作：
先用该酶却质粒，然后用T4DNApolymerase补平，这样你有一端就成了平端了，但是由于缺少了tg两个碱基，那么再你连上你的基因的时候必须考虑加上tg,或者自己带上ATG
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发表于 2014-6-4 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好！本人已经使用PET-30（a）表达载体表达出分子量为20KD的目的蛋白，表达量达到30%，以可溶性表达形式存在。而且纯化出的蛋白效果很好！使用的酶是NdeI和BamH I，利用了蛋白的C端所带有的一个his.tag标签。根据自己所做的过程中遇到的一些问题，提一下自己的观点：
1.做课题当然也是要考虑经济的，但更重要的考虑你做出的东西的目的和用途，另外，选择合适的酶切位点可以减少很多不必要的重复劳动
2.我选择的这两种酶可以找到通用buffer，我用的是TAKARA，你也可以再看看别的公司的产品目录及网站上产品介绍
3.NdeI比较难切，但只要延长时间完全可以切的很好。虽然NdeI要求用平末端连接条件，但现在一般的T4DNA连接酶使用普通条件都可以连接上，甚至是连接两段RNA
4.我同时为了去除BamH I序列后，his之前的氨基酸序列，我同时使用了NdeI和xhol这样一对酶，但xhol更是难切难连，最终没有成功
5.最近我在检测目的蛋白活性时，发现蛋白的活性很好，可见那一段氨基酸序列并未影响蛋白的活性。当然不同的蛋白性质不同，或许一个氨基酸残基就可能影响蛋白的活性，楼主视情况而言！我只是建议，希望对楼主有所帮助！
6.另外，提醒楼主，若下游使用BamH I，别忘了在酶切位点后增加两个碱基，以免造成移码，his标签无法翻译（因为开始我就犯了这样的错误，汗呀！蛋白都表达了，又重新合成引物，从头开始----------）。
祝你好运！
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