【求助】关于非还原PAGE

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标题:【求助】关于非还原PAGE

dior[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们的目的是想通过在蛋白胶上来反映变性蛋白与非变性蛋白的差异，我是这样做非还原PAGE的：跟SDS-PAGE的差异就是在制胶时及电极缓冲夜里都不加SDS，而样品不做任何处理，上样缓冲液里也没加SDS和巯基乙醇。跑胶的结果是：连MARKER几乎像跑不动的感觉，一片弥散，我用12% 、15%、8%的胶跑的结果都是一样了。而同样的样品、试剂做SDS-PAGE银染没任何问题。我所使用的MARKER最大分子量是用94K，我的目标蛋白分子量为18K左右。希望能得到你们的帮助，多谢了。

is2011[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MARKER跑不动的话，是胶的问题
或者是样品缓冲液的问题。
你的样品缓冲液是什么？

dior[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

绝对不是胶的问题，样品缓冲夜为Tris(PH6.8), 嗅酚蓝和甘油，我的胶及样品里都不加SDS及巯基乙醇，因此它是非变性及非还原电泳，因此跟蛋白分子量、电荷密度及形状都有关，由于我们的目的是区别变性与非变性，也就是与蛋白形状有关，而两者之间分子量几乎没差异，胶浓度不是问题，问题是怎么样可以让变性与非变性之间蛋白的电荷密度一致，如果他们一致，就剩下形状，就可通过胶上反映出来了

plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用的marker是用于SDS-PAGE的吧，里面已经加入了SDS了，怎么可以用来跑非变性胶呢？

yysr238[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先,你跑非变性胶的时候要确定是应该用碱性还是酸性电泳电泳.
按照你的意思.你跑的应该是碱性电泳了.那你的蛋白等电点应该小于7才行.否则要换酸性胶.
还有非变性不连续电泳一般根据蛋白的分子量和形状不同达到分离效果.(与带电电荷数量也有一定关系)
经过SDS 变性的蛋白与非变性的蛋白电泳现象肯定有很大的差异.因为他们电荷肯定有差异(SDS导致).形状也肯定有差异(SDS把蛋白变成棒状结构.而天然蛋白很多是球状的,也有其他形状的).所以你的试验感觉对照意义不大.
非变性胶可以用来区别同一种蛋白的不同构象(如天然的和变性蛋白的构想不同.一般可以用非变性胶区别)
还有非变性胶有专门的marker.不能用SDS-PAGE的marker的

dior[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对我跑的是碱性电泳，样品的等电点在5.8到6.5之间，我们实验的目的是这样了，我们是想验证下我们蛋白纯化过程蛋白的复性率，本来验证复性常用反向HPLC，由于条件限制，我想通过非变性及非还原电泳来鉴定。所以请lijian10007 能否提供下非变性及非还原电泳的一些配方，如样品缓冲液，电极缓冲夜（上下槽的成分要一致吗），胶的配方等，多谢了。特别样品缓冲液需要遵照什么样的原则等。

3648755[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本实验室的做法：
1.电泳夜有SDS
2.上样buffer没有SDS
3.电泳前样品加入buffer后37水育30min
4.上样电泳

dior[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看了您的配方后，我实验所用的配方几乎跟您的一致。但结果却不理想，您有这方面实验的图片吗，能提供参考下吗？
我实验的配方几乎按照宝生物商品目录后提供的配方。（见附件）
由于我跑的蛋白是包含体了，跑的结果看不到目的蛋白，一片弥散。
Running Buffer x1
Trizma  0.025M
Glycine  0.25
我在实验过程中没对电极缓冲液进行调PH值。
上样缓冲液 x5
Glycerol  5ml
H2O 定容至10ml
0.5M TrisHCl pH 6.8 2.5ml
Bromo Phenol Blue  25mg
由于我们的电泳槽很小，用5ml制备分离胶就行了。下面三中浓度都试过了。
% Acrylamide  8%  12%  15%
1.5M TrisHCl pH 8.8  1.3 ml  1.3ml  1.3ml
30% Acrylamide  1.3 ml  2.0 ml  2.5 ml
H2O 2.35 ml  1.65 ml  1.15ml
10% APS 50 ul  50ul  50ul
TEMED 2 ul  2 ul  2 ul
浓缩胶配置（5%）：
% Acrylamide 5%
1.5M TrisHCl pH 8.8 0.25ml
30% Acrylamide 0.33ml
H2O 1.42 ml
10% APS 20 ul
TEMED 2 ul
我做过连续电泳及不连续电泳，结果几乎一样，到现在还没摸出来，希望能得到您的帮助，真的十分谢谢了。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你把你电泳结果贴一个图上来!让大家看看是怎么回事
还有非还原电泳的蛋白感觉不象SDS-PAGE那样会形成很明显的条带.不过不会弥散啊!
其实我做非还原电泳也不多。有很多不懂的地方.希望更多高手参与讨论!
附件是我电泳结果
没有marker,效果不是太好!只是让你看一下非还原电泳的结果.应该还是有条带的!

附件

2014-6-10 16:33

15471653.jpg (10.83 KB)

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得还原和非还原的区别在于loading-buffer中是否含有变性剂，不管SDS的事，SDS的主要作用是掩盖蛋白质本身的电荷，使所有的蛋白质都带上负电荷。如果没有SDS的话，电泳中蛋白质不会跑的。

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