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标题:【求助】关于植物总蛋白的提取问题

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于植物总蛋白的提取问题

请问一下植物材料特别是果肉材料的蛋白提取有什么特别需要注意的地方呢，以下是我提取的试剂及步骤，请各位高手指教
50mmol/LTris-HCl（PH=8）、0.2%PVP、1mM PMSF、2%巯基乙醇、50mM EDTA
操作是液氮研磨成粉，加入提取液冰浴提取30min，后离心取上清液
*问：如果至此就直接作为2D-PAGE的样品可以吗？
我后面也做过提纯，用4倍丙酮-20度沉淀蛋白2次，但每次沉淀完离心，都会分三层，由上到下是：透明溶液（丙酮）- 白色一薄层（估计是蛋白）- 最底的外观象黄油一样的液体。由于黄油状物质沉在最底部，所以很难除去，估计有可能是多糖或者果胶之类的物质（我的材料是果肉）
*问：具体是什么还请高手指教。
*问：最后用抽真空去除丙酮的时候，是不是要用低温的？（我之前做的都是常温下的抽真空，因为仪器控温组件坏了~~）
抽真空后得到的也不是一般书上说的粉末状蛋白，而是胶着在一起的一块白色不透明的小块。
*问：这个有没有问题呢？要保存蛋白的话应该先溶解了再保存还是直接保存？溶解的话用什么溶液，是同提取液的Tris体系缓冲液还是用dd水就行？我之前做发现那个白色小块很难溶，我是用dd水溶解的，这是什么原因？
望高手指教，先行谢过了！！
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发表于 2014-6-10 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问PMSF起什么作用，我在提取叶片蛋白，用丙酮抽提后，用上样缓冲液泡一夜来融解蛋白，可是SDS－PAGE就是跑不出来。
还有你加的EDTA作用是不是去除PVP中的金属离子？
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发表于 2014-6-10 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PMSF是一种蛋白酶抑制剂，巨毒（有资料说是致死的），就是防止蛋白降解的
你的上样缓冲液中什么组成啊？没有加蛋白酶抑制剂的话很容易引起降解的。建议你的样品溶解后测下蛋白含量吧
好运~~
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发表于 2014-6-10 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的上样缓冲液是 50mmol/LTris-HCl（PH=6.8） 5%巯基乙醇 2%SDS 10%甘油 溴酚蓝
还有你加的EDTA作用是不是去除PVP中的金属离子？
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发表于 2014-6-10 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我查到的资料都没有加PMSF的，请问你是参考的什么资料？
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发表于 2014-6-10 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
居然反过来回答问题了，呵呵，也好，互相交流嘛
EDTA也是一种蛋白酶抑制剂，不过他们抑制的效果不一样，还有很多其他的抑制剂，EDTA是最常用的一个在蛋白提取中，至于你说的驱除PVP的金属离子这个我就没有听说过了
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 小中大

其实PMSF可以不加不加也好，我查的资料很多有加的，我的提取液配方是参考了8个方法然后汇集而成的，由于各有改动所以就开帖求教
PMSF的作用很多资料都有的，只是这个东西巨毒，用的时候要小心
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发表于 2014-6-10 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

保存蛋白 用粉末状的可以放到-20或者-80 长期保存
而溶解的可以在4度保存一周
抽真空用低温是为了避免蛋白的降解
溶解液的配方可以和裂解液一致
不过按你的配方不太好 会影响双向电泳的效果
可以直接参考公司给的配方
安玛西亚的溶解配方不含IEF BUFFER是
8M 尿素 2%(w/v)CHAPS 痕量溴酚蓝 DTT现加 每2.5ml加7mg
如果你跑的是一向的SDS-PAGE可以用上样缓冲液重溶
用来跑一向时 两种的我都做过,自己觉得直接用双向的重溶液 ,重溶效果好一些 .
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发表于 2014-6-10 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上，我只跑SDS-PAGE，那么你说的双向的重溶液就是 8M 尿素 2%(w/v)CHAPS 痕量溴酚蓝 DTT现加 每2.5ml加7mg ？不加别的了？尿素是什么作用？
融解和上样是一个配方的缓冲液？
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 小中大

裂解液主要成分一般包括离液剂(如 尿素),表面活性剂(如CHAPS),还原剂(如 DTT),还有选择性的蛋白酶抑制剂等,尿素为离液剂,主要作用为改变或破坏氢键等次级键的结构,使蛋白质的肽链伸展开来,充分暴露疏水中心,降低接近疏水残基的能量,以利于蛋白的提取.
裂解液和上样时的缓冲液可以一样但是,一定要保证缓冲液的盐离子浓度不能过高,否则会影响等电聚焦的.
我们实验室的裂解液还含有Tris和硫脲(和尿素的作用差不多),但是缓冲液不含有Tris.
楼上要多看些于你课题想关的文献!好运!
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