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标题:【求助】长片段表达时是不是要切除信号肽序列呢？

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-6-10 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】长片段表达时是不是要切除信号肽序列呢？


大家好，我明年就毕业了，可是连一个小小的原核表达都还没有做出来，它不过是我课题的一小部分，所以我现在是有点着急了，我做的基因片段大约2950bp，原核表达载体已经构建好了，用的是PET30a，通过PCR和双酶切也都得到了相同位置的片断，是不是已经构建好了呢，是不是还必须去测序呢？我诱导过几次，可是没有表达，是不是还要找出基因片段的信号肽序列，将其切除呢，有哪位有经验的给指点一下啊？需要切除信号肽序列的话，用什么软件可以预测呢，有谁可以提供给我吗？Sad
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-6-10 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你表达的蛋白是包含体还是分泌表达,如果是包含体应该在包内的,如果是分泌表达信号肽当然是必要的为什么要切除呢
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发表于 2014-6-10 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是原核表达，因为还没有出来，也就不知道它到底是包涵体还是分泌表达啊，难道可以预测，我只是知道我要表达的蛋白应该是真核生物的一种跨膜糖蛋白，其它的我就不知道了，应该不是分泌型的吧～谢谢你，麻烦你再给解释一下可以吗？
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wu11998866[使用道具]
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 小中大

一般跨膜蛋白较难表达，即使表达出来了也会表达量很少。表达的时候如果跨膜片段不重要的话尽量切掉。还有你的片段有点大。所以就更难表达了。
原核一般没有糖基化修饰。
表达的时候要去除真核的分泌信号肽，真核信号肽在原核中不能识别。预测expasy上就有。我用如下网站在线预测：cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/')
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dodoit[使用道具]
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发表于 2014-6-10 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢～！没有糖基化修饰无所谓，只要能够表达出来就可以了，因此 ，跨膜片段切去也可以，可是我不知道怎么找，你说的跨膜片段和分泌信号肽是不是一个东西啊，expasy 是什么东东啊，是一个软件吗？希望你能够解释一下，介绍一下你的经验～！谢谢啊～！
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发表于 2014-6-10 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有再问一下，你说的比较难表达，或者表达量很少，指的是在已经切除了信号肽以后呢，还是信号肽没有切除以前比较难表达，因为我只要拿到大量的原核表达蛋白就可以了，不需要糖基化，是不是包涵体也不要紧～！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我说的难表达是切除信号肽之前的。信号肽和跨膜片段一般来说不一样。不过也有信号肽隐藏在目的蛋白中（可能就是你的跨摸片段）。你可以预测。
expasy 就是cuturl('www.expasy.org') 上面有很多常用的软件。
还有你的跨抹片段可以查一下相关文献看一下，应该有报道吧。切除跨抹片段可能对你后面实验有影响。所以要小心。
我这里有qiagen 的操作手册。里面有关于含有疏水和信号肽的蛋白的表达。不过太大传不了。你给我邮箱。我发过去！
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发表于 2014-6-10 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦，谢谢，我根据你给的网站，就是cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/') 网站 ，预测到了一个信号肽序列，你说信号肽序列跟跨膜蛋白不一样，那通过这个网址预测的话，只能预测信号肽序列对吗？我的这个基因好像没有跨膜区的报道，如果跨膜区没有影响的话，我就这样设计引物，然后进行原核表达好了，因为我只是要用原核表达的蛋白作一个多抗，这应该没有问题了吧？

你说cuturl('www.expasy.org') 上面的软件也可以预测跨膜区是不是这个意思，那我打开看看好了说句实话，我都不是很清楚信号肽的作用是什么，也就刚刚通过上面你给的软件预测时看了一下介绍，现在还模模糊糊的，当时我的理解就是这个基因的信号肽序列就是给你一个信号，告诉你哪个区段是起到跨膜作用的，分子这个方面本科期间接触的不是特别多，然后就来上研究生了，两年就要毕业，所以很匆忙的。
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dodoit[使用道具]
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 小中大
我明白了，我看过很多文献再介绍一个基因的结构时经常说这个是什么跨膜区、胞内区，胞外区，我不知道是不是可以这么叫，因为我看的都是外文文献，遇到这些术语，我就是通过查单词的意思，然后这么理解的，要是我的理解基本正确的话，我就明白了跨膜区是某个功能基因的功能域，是不是，那信号肽呢，比较正确一点的，容易让人理解的解释是什么呢？不好意思啊，我可能有些问题问的过于罗索，还希望不要心烦～！谢谢～！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 18:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

信号肽就是细胞定位的一种信号，他可以指导蛋白在细胞中定位。比如是膜蛋白，那该信号肽就可以把表达好的蛋白引导到质膜上。完成任务后就被一种酶切除。
你要作一个多抗不知道是干什么用的。你这个基因没有跨膜区的报道，是不是一个新的基因呢？要不你可以通过跨膜区的预测软件分析（一般跨膜区都是a螺旋）。再综合其他方面来确定。
我把qiagen 和 novagen的蛋白表达手册都发到你的邮箱了。你好好看看！
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