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我是新手,想请教高手一点蛋白研究的问题
我们初步研究发现一个新的基因(K)在上皮细胞有表达而且是分泌性蛋白,我们可以从细胞培养液中获取。目前想进一步研究筛选其互作蛋白(interaction protein)。因为互作蛋白可能是调控的因子,对于揭示k基因在调控网络中的位置具有意义。初步设想:
1. 通过免疫沉淀方法获取该蛋白以及互作蛋白(K蛋白与互作蛋白结合,可能同时被沉淀),上串联质谱测序。根据肽碎片比对分析,找出互作蛋白。
问题:该步骤是否可行,沉淀得到的产物量和纯度是否满足测序分析要求?
2. 通过亲和层析方法,将K蛋白以及互作蛋白结合到柱上,洗脱后纯化(分子筛等)。纯化后的产物测序分析。
问题:该步骤在洗脱过程中互作蛋白是否会与K蛋白分离,影响鉴定?纯化过程中变性也可能使K蛋白与互作蛋白分离,如何解决?
3. 如果用基于表面等离子共振(SPR)技术的BIAcore(Biomolecular Interaction Analysis)分析,如何去做,样本如何准备和预处理。互作蛋白的流动相如何处理?
谢谢!