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标题:【求助】关于一抗孵育时间的问题

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-6-18 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于一抗孵育时间的问题


以往做western的时候，一抗都是37°孵育二小时，不过日前觉得抗体结合似乎不是很好，一抗比例已经提高到1：200了，考虑了一下想增加孵育的时间。
尝试了一下孵育三小时，但是结果条带同样非常差，基本看不出条带来。不知道是不是有可能在37°，三小时，有抗体失活的问题，请问可能有这个情况么？
此外还想请教各位，抗体到底孵育多少时间比较合适呢？和蛋白的kd数有关系么？
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one[使用道具]
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发表于 2014-6-18 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过一抗4度过夜孵育，也做过37度室温孵育两小时，效果好像前者好一点。
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对，最好4度12小时以上，37度抗体会失活一些，灵敏度当然可能降低！
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就是说37度的化，不要时间长了对吧
那大概多少时间比较合适呢？1小时？或者2小时
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2小时 37度没问题
当然得看你抗体的效价
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们一般都是4度过夜，效果很好的
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我每次都是室温下2－5个小时孵育，效果也不错啊。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们是室温1h,或者4度过夜也行，我们一直都是这么用的，应该没什么问题。
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抗体是新定购的，效价不会有下降的，应该还很好
那我们下一次就还是用37度2小时吧，谢谢大家的热情帮助
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-6-18 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的经验:
1.一抗,二抗都是室温孵育三小时
2.楼主最好用杂交槽,小平皿也可(费抗体)
3.杂交袋有时会和膜贴在一起,有可能造成抗体接触不到目的带,需要自己随时观察调整,最好1.5h把袋子翻一下.
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