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标题:【求助】western背景总是很深

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发表于 2014-6-18 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western背景总是很深


我最近做western,用碱性磷酸酶标记,可是染色后背景总是很深,我用含5%脱脂奶粉的TBST,是不是我的脱脂奶粉有问题啊?不知各位都用什么牌子的脱脂奶粉,我用的是伊利高蛋白高钙脱脂奶粉.是不是高蛋白影响啊?看见有进口脱脂奶粉卖的很贵,100克要300元.而且还有杂带,我降低了二抗浓度,没有结果,而且背景依然还有.请各位帮帮忙!谢谢!
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

方法：
1.二抗浓度是最主要的，再降低二抗浓度。你说你降低了，那么再降！！不要怕降到推荐浓度下
2.延长一抗、二抗后洗膜时间，可以尝试 15min*4
3.减少曝光时间
4.封闭可用更高浓度的牛奶，15%都可以，我自己用的是光明牌的，效果很好，比公司卖的Western专用封闭液也不差哪去
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

主要是封闭的问题
我一般是5%脱脂乳封闭一夜!!效果不错
不知道你的实验条件是怎么样的
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any333[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

降低抗体孵育时间，降低一抗／二抗浓度．同时提高封闭时间．
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用的脱脂奶粉和你用的是一样牌子的！没有问题！一般背景很深应该是封闭的问题！
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用的脱脂奶粉和你用的是一样牌子的！没有问题！一般背景很深应该是封闭的问题！
但是 我们封闭过夜和2小时都做了都很好 ！
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


封闭用光明牌的,的确不错,价格便宜,量又足,我一直用它.5%
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发表于 2014-6-18 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位帮忙！我一般4度封闭过夜，可还是背景深。我再降低一下二抗的浓度看看，由于我们还没有建暗室，我用碱性磷酸酶标记，我的显色液是买的天为的BCIP和NBT，不知有没有可能是显色的问题？请教各位暗室应该怎么建？我们正准备建可是不知用什么材料和具体要求，请各位指点一下，谢谢！
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发表于 2014-6-18 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
封闭过夜!
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 小中大

谢谢各位的帮忙，我做了几次总有两条杂代出现，我用的是santa cruz的一抗，蛋白是tubulin，不知有没有人做过，能不能是抗体的问题？还是蛋白本身由于自身的结构容易出现杂代？
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