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标题:【求助】询问毕赤酵母表达问题

xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】询问毕赤酵母表达问题

本人刚开始作毕赤酵母表达，碰到了一个实质性问题，我的欲表达蛋白前端有一个信号肽，设计引物时没有注意到这个问题，现在就带着信号肽直接连到载体上了，前面的工作都作完后，发现甲醇诱导表达的上清液中检测不到目的蛋白，不知是不是我引入的这段信号肽影响了目的蛋白的表达，请高手赐教！急！
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发表于 2014-6-19 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做毕赤酵母表达, 专门查了一些资料,结论是要把信号肽去掉,否则影响表达. 我是把信号肽去除了以后才连的载体,我的现在也没有做完.有个文章可能对你有用. 他的做法很详细,可供参考.
黑曲霉 N25 植酸酶 phyA 基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究
王红宁　马孟根 　　吴　琦 　　刘世贵 　　罗　燕
菌 物 系 统 20（4）：486~493, 2001
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发表于 2014-6-19 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能表达量低，考染检测不到。你可以把样品浓缩一下再跑胶，或者用银然来检测。
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人刚开始作毕赤酵母表达，碰到了一个实质性问题，我的欲表达蛋白前端有一个信号肽，设计引物时没有注意到这个问题，现在就带着信号肽直接连到载体上了，前面的工作都作完后，发现甲醇诱导表达的上清液中检测不到目的蛋白，不知是不是我引入的这段信号肽影响了目的蛋白的表达，请高手赐教！急！

=========================================================

1.基因序列分析：
1.1 5‘端的AT含量是否过高？
1.2 基因序列中是否有酵母不常用的密码子？
2.氨基酸序列分析：
两个碱性氨基酸相邻的频率是否过多？
3.排除以上原因，那，重新设计引物，重新构建表达载体，进行表达实验。
个人看法，仅供参考。
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的载体是什么？
经过G418筛选了吗？还是从克隆里面大量筛选呢？
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位高手的回复!

想向您请教一下如何查哪些密码子是酵母不常用的密码子,谢谢!
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的载体是pICZα，经过筛选了 ，表型也筛了，就差最后诱导表达了，已经用甲醇诱导过一次了，但是用考没检测到，有点急。
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发表于 2014-6-19 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.pPICZalpha的转化子是用Zeocin进行筛选，这样的设计比pPIC9K构建简单，容易，耗时短；
2.有专门关于酵母密码子的使用频率表，你可以在网上搜索一下，就可以找到；
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发表于 2014-6-19 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前面的信号肽会影响你的表达,你可以重新设计引物来重做表达.我所在的实验室以前也遇见过这样的问题!
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