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标题:【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？

15%分离胶，4％浓缩胶，Tris-Glycine-SDS体系，
30ug蛋白上样量，50ul体积。
0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果不是试剂问题，那只能是样品问题了。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品一般会有什么问题呢？
是上样量过大么？
因为是显内源的蛋白，所以上了30ug
按理来说，这个上样量不算大呀
我用的是BIO-RAD的电泳仪，1.5cm，10孔的，最多可以上80ul的量，我上50ul也不算特别多啊
虽然试剂没问题，但是实验条件也许有一些不足之处
比如电压啊
是不是应该放4度电泳啊之类的
比如吧2*的loading buffer换成4*loading buffer会不会好一些呢？
比如换成5％的浓缩胶或者浓缩胶的长度弄长一些会不会对跑胶效果有影响？
我不知道跑成上面这种样子的条带一般是什么原因造成的，所以很希望有经验的战友给予指点，我也好相应的改进实验条件
有没有谁比较有跑15％胶的心得体会呀
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，好像我显内源的蛋白都很难跑得好看
难道都是因为上样量太大的原因么？
而且内源都是兔二抗，显出来条带都很不sharp
唉
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶凝得不好？还是电压的问题？
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是4度电泳不是一个很严格的因素。
从你的电泳图上看，感觉像胶凝得不是很均匀，不知道你作胶的时候感觉胶凝的状态如何
浓缩胶可以适当的长一些也会对你的电泳有所改善，另外，你是恒流电泳的，我一般是恒压，浓缩胶跑100v，大概5-7min，进入分离胶后，恒压150v，跑出来的效果感觉不错
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么样才可以使胶凝得比较均匀呢？
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把你的电泳缓冲液重配一下,不是盐离子浓度大了(也可能上下槽液重复使用次数太多导致)就是PH值不对。另外注意电泳时电压电流不要太大.
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在想有没有可能是你丙烯酰胺没有过滤？
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-6-20 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也觉得是胶凝的问题，你可以减少APS的量，适当的延长胶聚合的时间。祝你试验顺利！
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