醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质（二）

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标题:醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质（二）

rmhot[使用道具]
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发表于 2014-6-26 19:18 资料个人空间短消息加为好友

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关键词：二级标准物质  食品安全检测  兽药残留检测  有机标准样品
  【操作步骤】
  1．准备
  (1)电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架距离2～2．5cm，支架宽度调节在5．5~6cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥。
(2)CAM的准备：选择厚薄一致、透水性能好的CAM，在无光泽面一端1．5cm处用铅笔轻画一横线作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后(约20分钟)用镊子取出。
2．点样
(1)将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。
(2)用血红蛋白吸管取待测新鲜血清3～5µ l，均匀涂布于点样用有机玻璃片或X线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在CAM无光滑面画线处，待血清完全渗入薄膜后移开。
3．电泳
(1)将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样端置于阴极，用滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡5分钟。
(2)将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极连接，打开电源，调电压为8～15V/cm膜长或电流0．3～0．5mA/cm膜宽。夏季通电45分钟，冬季通电60分钟。待电泳区带展开3．5～4．0cm，即可关闭电源。
4．染色  用镊子取出薄膜条直接投入丽春红S或氨基黑10B染色液中染色5～10分钟。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良。
5．漂洗  准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。
6．定量
(1)洗脱比色法
1)氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在白蛋白管内加入0．4mol/L NaOH溶液6mL(计算时吸光度乘2)，其余各管加入3mL，于37℃水浴20分钟，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。
2)丽春红S染色法：用0．1mol/L NaOH溶液脱色，加入量同上，10分钟后，向白蛋白管中加入40%(V/V)醋酸0．6mL(计算时吸光度乘2)，其余各管加0．3mL，以中和部分NaOH，使包泽加深。用520nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。
(2)光密度计扫描法
1)透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄玻璃间，供扫描用；要保留的电泳图可用冰醋酸乙醇法或N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明。将薄膜放入透明液中2～3分钟(延长一些时间亦无碍)，然后取出，以滚动方式平无划痕的载玻片上(勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去一定的透明液后，于70～80℃(N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明，90～100℃)烘烤15～20分钟，取出冷却至室温，即可透明。
2)扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长520nm，描记各蛋白区带
峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量。
  【结果计算】
   各组分蛋白质％=AX÷AT×100
  AX表示各个组分蛋白质(Alb、a1、a2、β和γ-球蛋白)吸光度。
  AT表示各组分蛋白质的吸光度总和。
各组分蛋白质绝对浓度(g/L)=血清总蛋白(g/L)×各组分蛋白质百分浓度(％)

[ 本帖最后由 rmhot 于 2014-6-26 19:20 编辑 ]

上海丰核[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:17 资料个人空间短消息加为好友

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下面那个也可以做实验的，还能写论文，很不错