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标题:【求助】仅仅抗体SDS－PAGE电泳应该几条带

daod[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】仅仅抗体SDS－PAGE电泳应该几条带


我想问一下，如果仅仅就一种抗体进行SDS-PAGE电泳，应该出现几条带?
还有个问题：我在文献上看有免疫印迹的，在一张膜上分别针对磷酸化的和总的目的蛋白进行抗体孵育，最后出现两条带分别代表磷酸化状态的蛋白和目的蛋白总含量（包括磷酸化和非磷酸化）。是一种蛋白的两种状态。
我的疑问是既然是一种蛋白，那么在膜上印迹时,就应该只有一条带，不应该是 两条带呀？这个问题我一直 想不通
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳里面，抗体分子就会解体成大小两个亚基，因此在跑电泳的时候应该是上下两条带．不过你的问题我还是没有听太明白．
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对楼主所说的情况，我是这样理解的，分别孵育抗目的蛋白抗体和磷酸化抗体，用一种抗体显影以后，把抗体用Striping Buffer洗掉，重新孵育另一种抗体。没有磷酸化的蛋白可磷酸化的应该是在一条带上吧。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，我没有说清楚。楼上说的就是我的意思。但是我看文献上没有磷酸化的和磷酸化的恰恰不在一条带上。所以我百思不得其解呀。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果按照你的意思，单独抗体电泳会分出两条带，那么免疫沉淀后紧接着电泳是不是也应该出现两条带？可是我看到有的文献是两条，有的是一条;为什么呢？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-7-2 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第一，免疫沉淀，对于沉淀下来的蛋白，如果它的分子量恰好是抗体重链的大小，那么通常免疫沉淀后走电泳时的sample buffer里就不加2-ME，这样抗体轻重链不分开，总分子量大于100KD，避开了可能与目的蛋白分不开的可能。所以电泳出来抗体只有一条链。相反，如果目的蛋白大于100KD，那么就加2-ME，抗体出现轻重两条链了。
对于你的第二个问题，我想是不是有很多文献，上面的图有时候并不是一张片子，而是两次曝光的片子，剪下目的条带放在一起做比较呀。实际上磷酸化和总蛋白量肯定是比较同一条带的蛋白。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-7-2 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

完整抗体分子量150KD左右, 在不含2-ME(2-巯基乙醇)的SDS-PAGE电泳时,目标蛋白条带应该在150KD左右,但通常在160KD附近还会出现一条较弱的条带, 但用HRP-Protein L做Westen Blot时都会出现阳性反应,一般认为其也是免疫球蛋组分,不影响后续实验结果. 含2-ME(2-巯基乙醇)的SDS-PAGE电泳时,即通常所说的还原SDS-PAGE,因为连接抗体重链和轻链的二硫键断裂,所以会出现2条链,重链5KD, 轻链2.5KD.
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-7-2 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位考虑的单纯是IgG么，如果是多抗的话，还有其他的抗体组分，如IgM，我认为实际上的SDS-PAGE 更复杂。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-7-2 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我大概明白了一些。但是我还不明白的是为什么仅仅就抗体SDS－PAGE（即使是非还原性的）也会出现两条带呢？？这是抗体技术实验指南书上说的。
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glass[使用道具]
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发表于 2014-7-2 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 daod 于 2014-7-2 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我大概明白了一些。但是我还不明白的是为什么仅仅就抗体SDS－PAGE（即使是非还原性的）也会出现两条带呢？？这是抗体技术实验指南书上说的。

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