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标题:【求助】WESTERN转膜成功，一、二抗1：100，ECL显色仍...

hustwb[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WESTERN转膜成功，一、二抗1：100，ECL显色仍...


本人近2月用WESTERN-BLOTING做培养心肌细胞ERK1/2,P38MAPK磷酸化水平（分子量分别为42、38KD）测定，选择10%分离胶电泳，条件是恒压，积层胶内120V，分离胶内为180V，考马斯可见蛋白条带。
转膜条件为恒流190mA*150分钟，丽春红染硝纤膜也可见明显且整齐蛋白条带，然后是TBST洗3遍，封闭2小时或过夜，一抗从1：1000一直做到1：100
过夜或4小时，二抗结合是2小时，浓度也是从1：1000一直做到1：100，ECL显色却都是光板，无任何条带，连杂带都没有。
有同学在跟我一起跑电泳和转膜，同样是用以上条件，他是28KD蛋白，方法是一样的，只是抗体不一样，他却成功了。
我曾认为是ECL的问题，但换他的ECL还是光板，我试了试用纯二抗（未稀释）滴在纸上，ECL显色可见有荧光出现，而用5%牛奶配制的二抗液用同样的方法，却没有任何荧光。
强烈郁闷中，真心希望大师们帮忙！
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发表于 2014-7-3 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你有阳性对照吗?一般来说做western blot最好既有阴性对照,又有阳性对照.在同一张膜上,如果阳性对照有好的结果,而你的样品没有显色,那说明你的样品中没有你的目标蛋白或者浓度太低无法检测;如果连阳性对照也没有显色,那么说明你的Western blot方法有问题或者一抗,二抗等试剂有问题.
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有内参照吗？出来了吗？
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发表于 2014-7-3 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用WESTERN-BLOTING做培养心肌细胞ERK1/2,P38MAPK磷酸化水平，应该是常规操作，我的建议如下供参考：
（1）我不知道你用的裂解液是何配方，请告知，因为磷酸化抗体的检测需要在裂解液中加入防止去磷酸化的试剂，如正丁酸钠，氟化钠或焦磷酸钠
（2）你可以做一下非磷酸化的ELK、P38的检测看能否做出条带
（3）你上样量的大小可能也要考虑进来
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢各位战友的热情解答，战友提醒是否有阳性对照，本人有所不知是否是已知含需检测的样品？
楼上所提醒磷酸化ERK需加防去磷酸化的试剂，这我倒是从未考虑过，因为看到的文献做此项检测的蛋白裂解液五花八门，我起初想用三去污裂解液，但EDTA和鹅胆酸不溶，也不知是何故，后来就改用他人买的蛋白裂解液，但不知是什么成分，我明天再去问个究竟。
还有内参，我明天去试试。用同一张膜看看。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说的阳性对照指的是你的磷酸化ERK纯品(购买或者自己纯化得到)或者是已确定含有可检测出的磷酸化ERK的样品,也就是你说的"已知含需检测的样品".阳性对照必须是正常条件下很容易就能做出显色结果来的样品.
另外,你提到裂解液中EDTA和鹅胆酸不溶,不知道你配溶液时是直接加药品粉末还是加已配好的EDTA和鹅胆酸浓缩液?用后面的方法估计可以解决你的不溶问题.
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是直接加药品粉末，前一次我们师姐顺利地溶解了，但到我手上怎么做都不溶，她自己做也是不行，估计您提醒的方法一定行，往后我试试看。
后来改用他人的裂解液，是普利莱公司生产的总蛋白提取液。
不知是否会影响磷酸化ERK
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-3 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，不用谢。补充说明一下，EDTA在pH小于8时是不溶的，所以一般情况下是先在pH大于8的条件下配成浓缩液(可用NaOH调pH至8)，再取适量加到你要配的溶液中去。类似的其它不少药品也是在特定条件下才溶解的。他人的裂解液如果成分不明的话，我想最好还是用三去污裂解液吧，不少文献上都是照这个裂解液来做的。
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发表于 2014-7-3 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在此做点补充：ＥＤＴＡ溶于热水，所以在配含ＥＤＴＡ的溶液时，可先将溶液加热一下，再加入ＥＤＴＡ即可很快溶解了，而且并不影响ＥＤＴＡ的性质．我曾用过这种方法，在加热不影响溶液中其它成分性质的前提下，适当加热是一种很好的方法，不妨试试．（或者你可以单纯用热水溶解ＥＤＴＡ，然后按照适当体积将该ＥＤＴＡ溶液加入所配置的混合溶液中．）
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hustwb[使用道具]
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 小中大

非常感谢各位的解答，我想再问一个问题，防去磷酸化的蛋白裂解液配方哪位高人有？
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