【求助】封胶的橡皮条,呵呵,人家可能用的是bio-rad嘛.

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标题:【求助】封胶的橡皮条,呵呵,人家可能用的是bio-rad嘛.

any333[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问：我用pet-32表达了我的目标蛋白，想用做抗原制备多克隆抗体。目标蛋白是以包含体的形式表达的融合蛋白，我用8M的尿素进行溶解后上Ni柱进行纯化，但整个过程中遇到了很多的问题，以前没有做过，还是菜鸟。请大家帮帮忙，在此先谢过！我遇到的问题有：
1、溶解效果不好：菌体加含8M的尿素的磷酸缓冲液后用超声波破菌，室温溶解1小时以上，甚至过夜溶解，溶解效果均很理想，虽然溶解了一部分，但是大多数还在沉淀里。我也做过含尿素梯度的缓冲液，我的目标蛋白在0.5M的尿素就有溶解，好像增加尿素的浓度对他的溶解影响不大一样，我想换用盐酸胍溶解，但是后面又要上柱子，不知道有没有影响，此外含盐酸胍的样品不能直接跑SDS-PAGE，所以很是郁闷。
2、Ni柱吸附样品不够好：将溶有我目标蛋白的样品上Ni柱进行纯化，但是上样前后的样品跑SDS-PAGE分析，没有多大的变化。纯化过程发现有很多的非特异性吸附。纯化后样品不够纯，大概只有50%。
3、纯度较高的浓度过低：由于要用于免疫，要求蛋白浓度要达到2mg/ml。但我的纯品很少，并且浓度过低，由于实验条件有限，浓缩样品又是一大难题。实验室没有冷冻干燥的装置，也不能用超滤，打算选用透析来浓缩，但是透析用的PEG会进入到样品中，这对免疫兔子影响是否会很大？会不会导致兔子死亡？有什么方法可以浓缩蛋白后将PEG去除？
4、此外是否可以用包含体的沉淀来免疫兔子？如果沉淀纯度够高的话

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前做过一部分包含体的复性，有如下几点建议，但愿对您有用：
1、溶解效果不好：好多包含体的形成是因为在表达蛋白质的时候没有合适的氧化还原环境，所以会导致错配二硫键的形成，过多的错配S－S在包含体中，是不能简单通过高浓度尿素进行溶解的，需要8M尿素＋一定浓度的DTT（我用的是30mM，当然不同的包含体，可能DTT最佳浓度会有差别）才能溶解彻底，6M盐酸胍溶解效果要比8M尿素要好一些，但是没有DTT的话还是不行的，况且您好像后面还要电泳，若用盐酸胍会极大地影响电泳
2、Ni吸附样品不够好：除了ni柱本身作为亲和纯化本身就特异性不够高的特点以外（Ni与His结合，好多杂蛋白如果有几个连续的His如溶菌酶什麽的也会结合在上面），个人以为：变性的蛋白质过Ni柱时，会对结果有影响（以前有师兄做过，就是His融合包含体蛋白在过镍柱时怎麽也结合不上去），后来怎麽也找不出原因
3、纯度较高的浓度过低：建议除了透析浓缩之外，还可以尝试一下PEG浓缩蛋白，见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2399099_0.html')，
个人认为这样可能会好一些
4、个人认为是否：不可用包含体的沉淀来免疫兔子，但是可以用变性后的包含体蛋白来免疫兔子（好象要用8M尿素透析，除掉其它的变性液成分），这一点我个人没做过，但是同实验室的人做过，我也不知道为什麽他当时没有用包含体的沉淀而是溶解后再免疫
Good Luck！

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发表于 2014-7-4 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

变性后的蛋白更容易挂柱，因为与天然折叠状态相比，可以避免tag被包埋而无法与胶结合。但有时也需要还原剂协助打开，不同的柱子还原剂耐受性不同，有的可以耐受低浓度的还原剂。包含体蛋白用盐酸呱打开仍不挂柱应该是另有原因的，很多情况下都是天然状态下不挂柱，变性后就可以了。
要是8M Urea都溶不了，可以用盐酸呱溶解样品，但buffer换成8M Urea，根据情况加适当还原剂。这样可以跑电泳。
纯化的纯度不够，关键要进行优化，一般达到90%纯度还是可以的。
最常见的就是咪唑梯度洗脱，还可以结合pH洗脱，有时可以用低浓度的detergent降低非特异性吸附，提高纯度。
样品体积不大的浓缩用超滤离心管比较方便，几十块一个，可以反复用几次。

DNA[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主：
DONT说得对，我针对Ni柱吸附样品不够好，补充一点：
我觉得楼主最好加低浓度的咪唑如20mM来减少这种非特异性吸附。

glass[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，尿素溶解不能长时间，会使包含体生产甲基化还是什么的变化，导致蛋白的性质和结构发生一定的变化，反而导致包含体不好溶解。
建议还是用盐酸胍，6M的应该可以溶了，其他一些助溶的试剂和还原剂也加一点。
2，尽量先选IDA的his亲和柱，亲和力大一点，先确保蛋白能被吸附，然后加滴浓度的米错，减少杂蛋白的干扰。
如果杂蛋白实在是太多，可以试试NTA的，这个亲和力弱一点，也许能起到一定的分类筛选作用，一些菌体本身带少量组胺酸的蛋白不一定能吸附的住。
3，包涵体免疫，小分子量的蛋白完全没有问题，大分子量的就不一定了，
纯度7，80%也可以。
就是不知道你后期的多抗纯化用什么手段，如果免疫的效果不是很理想，特异性的抗体占总抗体的比例不高，那用protein A/G纯化出来的样品，可能会没法用

glass[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

针对包涵体免疫再补充一些
包涵体的沉淀只要研磨的足够细腻，其实免疫的效果可能更好，因为可以起到一定的缓释作用。
溶解后也可以，溶解了的包涵体可以和佐剂充分互溶

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-7-4 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

通常同配基密度IDA配基做填料的亲和带his标签要比NTA的强,而通常IDA作为配基的填料密度都要高于NTA,所以最强的是IDA.如果IDA挂不上,那NTA就更难说了.挂不大好用盐酸胍溶解样品是可以改善的.纯度关键看洗脱的条件.也可以换铜离子试试,不同金属离子选择有差别.

glass[使用道具]
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