【求助】SDS-PAGE 两条带，请高手指点！

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标题:【求助】SDS-PAGE 两条带，请高手指点！

idoww[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想请教各位一个问题：
我在抗体技术实验指南这本书上看到一个关于抗体纯化的内容。其中有一个环节我不太明白。大概意思是说如果抗体纯化的效果很高，那么SDS-PAGE电泳时，就应该出现清晰的两条带分别是重链和请链。我的困惑：既然抗体作为一个物质存在（重链和轻链是结合在一起才能形成抗体），那么就应该是一个分子量的条带出现。而不是电泳后的两条带。难道抗体的重链和轻链可以分解后单独存在？？

am10[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE时样品中含有巯基乙醇或DTT，可以还原抗体重链和轻链间的二硫键，从而使两种链能够分开。

nn255[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦谢谢，但是我总感觉到还有其他原因。你说的原因可能是主要原因。
不知道还有哪位高手做过这方面的给一点解释 thanks earina

loli[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过Ig的纯化，了解一点，简要谈谈。
二楼的说法是正确的，在血清中的Ig类型主要有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其中又以前三种含量较多。经过连续免疫后的动物血清一般以IgG含量最多，约90％左右，所以纯化也主要是获得IgG。IgG 的蛋白是由两条重链和两条轻链构成的，形成两个抗原结合位点，中间以二硫键相连。
当我们用盐析或层析的方法获得纯的IgG后，经SDSpage电泳便可看到两条带，其重链分子量为52kd，轻链为22.5kd，总分子量为160kd。
附：我做的血清IgG蛋白电泳图，供参考。

附件

2014-7-4 15:36

61238220.gif (17.48 KB)

131415[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教：
用盐析或层析的方法获得纯的IgG后，经非还原SDSpage电泳可看到一条分子量为160kd的带么？有图么？谢谢。

luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非还原sdspage电泳可以跑出来的，我以前跑过，不过图弄丢了

remenb[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在明白了
还有个问题是：做免疫亲和纯化的时候，有一个抗体－蛋白A微珠-层析柱制备，里面（抗体实验技术指南）说到了为了检测微珠样品（简单的说微珠就是蛋白A或者G之类）与抗体结合前后的结合效率，将样品分别取出1ul和9ul进行SDS-PAGE，用考染。结合前样品呈现重链区带，而结合后样品则无，表明交连成功。如何理解这段话呢？为什么结合前只有重链了呢？轻链哪去了？

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发表于 2014-7-4 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

G蛋白和A蛋白亲和层析的原理就是利用其可以与Ig的Fc’片段结合，来分离Ig与其他蛋白分开。如果G蛋白或A蛋白层析柱，其填料上附有A蛋白或G蛋白，若其与Ig成功结合，则样品中的Ig即被分离，所以过柱后的样品不再含有Ig。因而可用SDS－PAGE电泳来检测。若有Ig则分离不成功，若无即表示原样中的Ig已吸附到柱子上去了。

idoww[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我好象看到过亲和层析，是利用G蛋白或A蛋白与样品中的IG的Fc端结合来层析的。而不是你所说的与Fab端来结合的。也许是我理解错了，呵呵！我是看抗体实验技术指南那本书来理解的。请多加指教！如果是你所说的与Fab端结合，那我还可以理解。呵呵！

luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-7-4 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对不起!我记错了，是Fc端，谢谢指正！

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