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标题:【求助】磷酸化的EGFR westernblot 老做不出来啊！！！

Darcy[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】磷酸化的EGFR westernblot 老做不出来啊！！！

相关疾病：
喉肿瘤
用三去污裂解液（加了酪氨酸磷脂酶抑制剂cocktail）抽的是喉癌HEp2细胞的总蛋白，抗体用的是cell signaling公司的抗p-EGFR的小鼠单抗，westernblot 检测总EGFR效果很好,同时检测磷酸化的MAPK效果也很好，但磷酸化的EGFR做了好多次都不见条带（说明书介绍抗体浓度1：1000，我用1：500也做过，一抗也抚育过夜），个人觉得主要出的问题在两个方面，1、磷酸化的EGFR抗体不行，2、喉癌细胞株中的磷酸化EGFR太低以至于不能检测出来？但HEp2细胞好象EGFR的磷酸化水平应该比较高的啊！westernblot过程我觉得不会有问题。
所以我想请教各位，特别是HEp2的EGFR的磷酸化水平问题，希望有经验的兄弟热心帮助！
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是这样处理的,将EGFR质粒转染入细胞做为对照之一,增加细胞中EGFR的表达量来检测.同时可以抗体行不行,也解决了表达量低的问题.
祝你好运!
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发表于 2014-7-4 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位，不知还有什么方便的阳性对照？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EGFR有170KD，能不能说一下你的western条件？
我也在做这个蛋白，但是由于分子量太大，我每次转完膜就会发现大分子量的部分很少转到膜上去了。我跑的是6％ 的SDS-PAGE, 半干法30mA转2.5hr都很难能将大的蛋白转过去。
不知道是什么原因，能帮忙分析一下吗？
谢谢
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知还有什么方便的阳性对照？

=================

我有这个质粒,PM联系.
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utt0989[使用道具]
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 小中大

这个蛋白电泳,10%的胶就可以跑出来.
半干法转膜的条件我不知道,湿转我一般250mA,3h效果很好.
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Darcy[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是半干转的，25V,30分钟，EGFR还是很容易做出来的，条带很亮的
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
EGFR分子量有170KD
用10%的胶跑行吗？
你是用10%，250mA,3h，转的效果很好？
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问跑胶时分离胶的浓度要多少，电压多少？时间跑多久？
10%的好象跑不动，一直停在分离胶上边
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-4 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教你做EGFR时跑胶的浓度和电压及时间
谢谢了，急等
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