蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PVDF膜和NC膜

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 15  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】PVDF膜和NC膜

shkudo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114490
精华 0
积分 305
帖子 309
信誉分 100
可用分 2338
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
1

发表于 2014-7-5 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PVDF膜和NC膜


我一直用millipore的PVDF膜做Western的预实验，可是无论湿转还是半干转，markre总是转的不好，很容易转膜过度。而且不稳定，有时一个小时转的还可以，有时40分钟就转过了。
今天听同学的建议，用NC 膜和PVDF膜同时转，同样的条件。结果NC膜转的很好，PVDF膜就过了。不知道是什么原因呢？
我的膜处理是这样的：PVDF膜在甲醇中浸泡至少1分钟，再在转移缓冲液中平衡10分钟左右。问了代理的技术支持，他说是我的膜在甲醇里浸泡的时间长了，是这样的么？
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
2

发表于 2014-7-5 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
技术支持的回复应该是错误的，据我所知膜在甲醇里浸泡的时间可以长到数十分钟甚至一个小时，因此转膜转不上与浸泡时间没有必然联系。
既然用NC 膜和PVDF膜同时转，同样的条件。结果NC膜转的很好，PVDF膜就过了。所以可以肯定地说PVDF膜本身存在问题。
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
3

发表于 2014-7-5 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PVDF膜只能在甲醇里泡不超过10秒，我们用一般泡5秒，平衡一般是15min，你把膜都泡散架了怎么转啊。
顶部
BUK[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74485
精华 0
积分 521
帖子 701
信誉分 100
可用分 4361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
4

发表于 2014-7-5 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室一个叫小胖的人也遇到了同样的情况,不知道为什么，我估计是不是转移缓冲液的浸泡时间太短了，甲醇处理后,转移缓冲液应该处理长点的时间比较好
顶部
daod[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
5

发表于 2014-7-5 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是甲醇处理时间有点长了，10秒就足够了，可以再试一下，我这样处理，湿转过夜都没有问题。另外，转移缓冲液的浸泡时间应该也不会影响这么大。
顶部
shkudo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114490
精华 0
积分 305
帖子 309
信誉分 100
可用分 2338
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
6

发表于 2014-7-5 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家热心的回答，我又问了技术支持。他还把MILLIPORE的handbook也带来了。我又好好学习了一下。
书上说PVDF膜在甲醇中泡15秒以上，没有说上限。在缓冲液的平衡时间是15~30分钟。我看了一下，觉得就是一点和书上的不同，就是在甲醇中浸泡后在蒸馏水中要泡2分钟。我是把膜从甲醇中拿出来后直接放到缓冲液中。不知道这点是不是影响很大？
顶部
taoshengyijiu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77450
精华 0
积分 467
帖子 614
信誉分 100
可用分 3876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
7

发表于 2014-7-5 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近一星期一直在做WB，开始时，我转的也不好，时间是一样的，有时转的刚好，有时转过，有时转了一点，我最先开始怀疑的的就是PVDF膜，所以我严格控制我的PVDF膜在甲醇里泡过2MIN、用双蒸水冲3遍，转膜液15MIN，转的效果很好，但后来PVDF膜在甲醇里泡3MIN、4MIN，还泡过7MIN，转膜时间都一样，但转的效果也很好，后来就怀疑胶浸泡的时间问题，后来也排除了，那就只有转膜液了，我每次用完大还倒回去，后来我每次用新的，结果转的时间一定（时间长短自己摸好了），转的效果一般都很好，所以我打算配点转膜贮存液，这样就能保持条件一样了。你也试试看，这只是我的体会，不知正确否。
顶部
shkudo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114490
精华 0
积分 305
帖子 309
信誉分 100
可用分 2338
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
8

发表于 2014-7-5 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的朋友。
转印的条件我摸了快一个月了。这个元旦都没有过好。先是半干转，后来是湿转。膜上的MARKER一直转不好。MARKER的上样量从5微升（推荐量）到8微升到10微升，都只看到一到两条MARKER条带在膜上。
这个元旦我按照millipore的handbook处理膜，每次也用的新的转印缓冲液，结果还是一样。很容易转过了。
今天我用NC膜和PSQ膜再转（条件和PVDF膜一样），NC膜上的MARKER条带就好的很，PSQ膜有一些条带，比PVDF膜强。我想我是不是要用NC膜了。唉！
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
9

发表于 2014-7-5 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同情楼上的朋友，PVDF膜本身是疏水的，甲醇润湿的目的在于把膜有疏水转换到亲水，此时膜有不透明变为半透明，根据你的处理，我想这一步问题不大。另外，需要注意你的蛋白大小，你后来提到0.2孔径的，我想这与你的蛋白小有关，你也可以看一下胶里的蛋白是否转移出去。我看过millipore的handbook英文版和中文版，里面有具体的方法。
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
10

发表于 2014-7-5 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，个人觉得pvdf为惰性材料，我想不太会出现散架现象吧。另外，注意一下转移缓冲液中SDS的浓度。
顶部
 15  1/2 12››