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标题:【求助】免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的？

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的？


免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的？
各位大侠，假阳性是在哪一步产生的阿？
急用！
谢谢了！
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有就是谁有免疫共沉淀 的具体一点的protocal?
可否给我看一下？
谢谢！
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也刚准备做这东西,
我想假阳性产生是因为抗体的特异性不高,
结合了其他非目的蛋白.
想听听高手意见
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这篇protocol还不错
可以参考一下
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丁香园里有很多：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/search#result')
列几个：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/4286638')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4070885_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1454279_0.html')
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memory[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的？
各位大侠，假阳性是在哪一步产生的阿？

==========================================================================================================

分析一下COIP的步骤，我觉得可能是这些情况
1，beads没洗干净，或者某些蛋白容易吸附在beads上
2，用于IP的抗体特异性不高，与某些蛋白有交叉反应
3，用于IP的抗体杂带被WB的抗体检出，而分子量与你的目的蛋白相近
4，WB用的抗体特异性不高，与某些分子量接近目的蛋白的杂蛋白蛋白有交叉反应
5，假设你IP蛋白A用WB检测蛋白B，而A和B分子量相近，而WB中所用的抗体又和A有一些交叉反应，这时候在B的位置上也会有淡淡的条带。。。（听上去好像很少见，但我也遇见过）
所以对照是要好好设计的，至少我做的时候会加这些对照
1，只有蛋白A，没有蛋白B的系统
2，只有蛋白B，没有蛋白A的系统
3，没有A，B，单加抗体的系统
4，没有A，B，抗体，单加beads的系统
5，如果用A成功COIP下来B，那么反过来尝试用B COIP A
此外，必要时还换不同的tag，不同的抗体，不同的细胞系统，buffer，诸如此类
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发表于 2014-7-5 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带，在实际工作中和目的条带如何区分？
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的？如果是的话，mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢？
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 小中大
一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带，在实际工作中和目的条带如何区分？
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的？如果是的话，mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢？

==========================================================================================================

一般IGg轻链和重链大约在20和50左右,由于变性条件不同,在没有加2-ME或者DTT之类不完全变性的情况下在分子量较高的地方也会有条带,当IP和WB用同一种属的抗体时尤其明显
如果同时做一个不加细胞裂解液,单有抗体和beads的对照,就能区别出这些抗体带了。如果抗体带很强,遮盖了目的条带或者影响了结果观测,只能想办法换抗体,换实验条件
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发表于 2014-7-5 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 memory 于 2014-7-5 18:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带，在实际工作中和目的条带如何区分？
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的？如果是的话，mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢？

=================================== ...


多谢解答，继续问问：如果在沉淀物中同时加入A、B（假设二者的确存在相互作用）各自对应的一抗和二抗，是不是最后的显色结果应当同时出现IgG、A、B三条带？
谢谢。
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发表于 2014-7-5 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

IP的抗体和WB的抗体来自不同种属就不会出现IgG的轻链和重链了吗？比如，用兔的多克隆抗体沉淀，用鼠的单克隆抗体做WB，还会出现轻链和重链吗？
偶联到Beads上的ProteinA或ProteinG在变性处理时会不会从Beads上脱落？如果会，那么WB时就会出现条带。大家有碰到这种情况的吗？
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