【求助】有关电泳的问题

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标题:【求助】有关电泳的问题

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用7.5％的胶分离脑脊液蛋白，胶聚合得还好，可是在200伏电压，50mA条件下，溴芬兰跑不动，仍在原地。仔细观察了一下，加样孔内没有气泡，另外我用的是北京六一的电泳仪，请问是怎么回事？谢谢！

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

"加样孔内没有气泡",不太清楚了,一般我都是注意电极缓冲液槽内的,也就是铂金丝周围是否有气泡.
我大概的提出几点,希望有用:
(1)电极被过分氧化了或两个电极根本没有接通,通电不畅,无电流.
(2)电极缓冲液是否已经加够了,至少要上槽没过点样孔和下槽要高出底线均在1cm左右.
(3)胶版是否已经夹紧了,是否有电极缓冲液渗透,导致上槽缓冲液渐渐的减少,最后,低于点样孔.
(4)电极缓冲液失效了.

mysmdbl[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充一下：
1.电极被氧化是一个方面，再看看你的电极线，是不是有断路的地方，换电极线一试就知道了。
2.你的电极缓冲液配错了，重新配制电极液，这要确保你所用试剂没有过期失效的。
3.至于发生漏液，肉眼很容易就看到了，低于加样孔，那问题就更好解决了。
4.还有就是胶有问题也会影响导电的，看看配胶试剂是不是存在过期失效的。

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢上楼战友的指点！
　　电极缓冲液应该没问题，电流可达７５ｍＡ，铂金丝周围也有气泡上浮．看来是："4.还有就是胶有问题也会影响导电的，看看配胶试剂是不是存在过期失效的。"
　　所有配胶试剂我们刚刚买的，应该不会过期吧．请问如何检测胶的导电性能？下面是试剂配方，请看看有什么问题？
2 PAGE电泳　
安装垂直板状电泳槽，将１０ml 7.5%分离胶注入，待凝胶聚合后，插入样品梳，再注入５ml浓缩胶。聚合后(约30min)取出梳子，对照血清标本以0.3∶1.7稀释，进样20μl，待侧CSF根据UV蛋白定量值，等蛋白量进样约(15μg)70μl。缓缓注入电泳缓冲液，即可电泳。电流30mA，冷却水温4℃，约2.5H。待指示剂至凝胶边缘处，关闭电源，取下凝胶，用考马斯亮兰染色约5min，加脱色液脱色2H即可。
3　试剂配制　
⑴ 3%分离胶缓冲液：（PH8.9， 3M Tris-HCl，4℃保存备用）
Tris 36.34g
H2O 10.15ml
1NHCL 46ml再逐滴加入直调PH9.0为止
H2O 加至100ml
⑵ 电泳分离胶(30ml 7.5%)：
PH8.9 HCI-Tris 　3.75ml
交联剂(30%) 7.5ml
水　　18.3ml
10%APS 　0.3ml
TEMED 　20μl
⑶ 浓缩胶缓冲液：( PH7.0，0.5M Tris-HC缓冲液，4℃保存备用)
Tris 6.057g
H2O 约20ml
1NHCL 38ml再逐滴加入直调PH7.0为止
H2O 加至100ml
⑷ 浓缩胶(10ml 3%)：
PH7.0 HCI-Tris 1.25ml
交联剂(30%) 1ml
水 7.64ml
10%APS 0.1ml
TEMED 10μl；
⑸ 上样缓冲液配制: -20℃保存
浓缩胶缓冲液 2.0 ml
87%甘油 1.0 ml
溴酚蓝 0.1 mg
H2O 加至10ml
⑹ 30%单体母液： 4℃保存备用一个月
丙烯酰胺 30 g
双丙烯酰胺 0.8 g
H2O 加至100ml
⑺电极缓冲液：用时稀释10倍
甘氨酸 28.8g
Tris 6g
H2O 至1000ml水中

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

师兄，你的分离胶的 Tris_Hcl缓冲液的浓度太高了，应该是PH8.8 1.5MTris_Hcl，其它都正常。

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对了，你的电极缓冲液：用时稀释10倍
甘氨酸 28.8g
Tris 6g
H2O 至1000ml水中
我不是那么用的，5倍电极缓冲液：用时稀释5倍
甘氨酸 93g
Tris 15.1g
SDS 5g
H2O 至1000ml水中

gogo[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在你确保这些无误的情况下检查一下你的电泳槽导电是否良好，不知老兄是用的什么封槽，如果是胶条切记取下，偶第一次做时就忘了去结果怎么都跑不动，换各种溶液最后才发现。。。呵呵祝顺利！

ha111[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

借该贴顺便问一下各位，如何加电泳缓冲液，可使胶底下不出现气泡？或有什么好办法除去气泡？

ha111[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有个问题，跑电泳时，溴酚蓝蓝色指示条带下面还有一粉红色带，请问是怎么回事？两颜色带之间有一小段距离。谢谢

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

借该贴顺便问一下各位，如何加电泳缓冲液，可使胶底下不出现气泡？或有什么好办法除去气泡？、

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用注射器把底部的水吸干，然后再用注射器向其中加水，直至没有气泡为止。

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