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标题:【求助】请教蛋白质疏水层析

biabiade[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教蛋白质疏水层析


1.蛋白质疏水性与哪些有关？怎样降低蛋白质疏水性？
2.最近我做了蛋白质疏水层析，用Phenyl sepharose 6Fast Flow(high sub)纯化样品（发酵液上清），缓冲液是20mMTris-cl（PH8.5），用不含硫酸铵的20mMTris-cl洗脱，能够洗下部分蛋白，再用水洗，还能够洗下部分蛋白，且水洗下来的溶液变混，做电泳，都有目标蛋白，请问为何不含硫酸铵的20mMTris-cl不能够完全将目标蛋白洗脱？且水洗变混？蛋白PI是6.0。应怎样改变条件只用20mMTris-cl完全洗下来？
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
疏水性和疏水氨基酸的多少有关,降低疏水蛋白和填料的作用可以再平衡和洗脱缓冲液中加吐温或者乙二醇,PEG,甘油等,都可以增强洗脱能力,同时挂柱子的缓冲液盐浓度别太高,你可以用NaCl代替硫酸铵,它极性要比硫酸铵弱,相同浓度作用力也弱点,洗脱加1%土温或者1-5%乙二醇,PEG,甘油等都可以增强洗脱效果.
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biabiade[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.我用的硫酸铵浓度为0.5M，应该不太高。一般采用多大？疏水层析与缓冲液及其浓度有关？
2.以前，我的发酵液中蛋白浓度不高，穿过峰没有目标蛋白，现在表达量高了，发酵液中蛋白浓度也高，条件一样，为何穿过峰出现目标蛋白？该怎样解决？
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将纯化填料换成疏水性较弱的应该会好很多。
穿过峰出现目标蛋白的话可以提高样品中的盐浓度。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.我用的硫酸铵浓度为0.5M，应该不太高。一般采用多大？疏水层析与缓冲液及其浓度有关？
2.以前，我的发酵液中蛋白浓度不高，穿过峰没有目标蛋白，现在表达量高了，发酵液中蛋白浓度也高，条件一样，为何穿过峰出现目标蛋白？该怎样解决？

====================================================================================================

不同样品浓度不一样,既然你0.2M都洗不下来,那就可以降低到这样的浓度,疏水色谱纯化效果和缓冲液种类,盐种类,配比等都有很大的关系.
现在浓度高了,也许你载量超过柱子能处理的范围,自然穿透就有,可以降低流速试试,或者少上点样品.
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biabiade[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般缓冲液种类,盐种类,配比等都是怎样的关系？采用哪种缓冲液种类,盐？
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发表于 2014-7-7 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一言难尽，你看看疏水色谱的综述吧
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biabiade[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，乙二醇,PEG,甘油通过CM柱能够除掉？甘露醇感可以降低蛋白疏水性？
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
都可以除去，不带电荷，甘露醇不能降低疏水性。
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了：降低缓冲液浓度为10mM20mMTris-cl（PH8.5），能够把大部分蛋白洗脱，洗脱液离心，但有蛋白沉淀，是何原因？用水洗，有少部分蛋白，是何原因？如果用磷酸缓冲液和降低PH洗脱，都不理想。我又做了：在缓冲液里加1%土温，洗脱效果和不加土温的10mM20mMTris-cl（PH8.5）差不多。我查过资料：蛋白在酸性条件下稳定，但是用HAC调发酵液上清液PH为4.0，然后离心，有沉淀，PI是6.0，快速调PH，因为蛋白在PI处易沉淀。这又是为何？
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