【求助】跑230kd蛋白的WB中的问题求助 - 经验共享

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标题:【求助】跑230kd蛋白的WB中的问题求助

whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-7-8 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈，我最近在跑分子量大约在230kd的蛋白，用的6%的SDS-page的胶，80V跑2-3小时，200mA转膜3.5h，一抗用5%BSA稀释1:1000,4°孵育过夜，二抗1:2000牛奶稀释，孵育1小时，TBST洗膜三次，每次10分钟，结果膜上一点痕迹都没有，求助各位大侠，跑230kd的蛋白有什么技巧吗？

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转印液用的什么？转膜的条件200mA我们转两个小时做280 Kda的蛋白都没有问题。另外就是你的样本究竟表达多少了？Positive control有没有？

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发表于 2014-7-8 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

western的几个问题:
1. postive control
你是否确定你的样品里面有230kd的这个蛋白表达？比如说过表达的样品。我相信你没有。
你是否确定你的抗体是好的？比如过表达一个flag tag的，然后看flag能否杂出来。
确定之后再来做trouble shooting
......

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我做的是VEGFR，这个要怎么做阳性对照？这个是固定表达的吧？抗体是刚买没多久的CST的，应该没问题的。

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发表于 2014-7-8 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转印液用的什么？转膜的条件200mA我们转两个小时做280 Kda的蛋白都没有问题。另外就是你的样本究竟表达多少了？Positive control有没有？

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我用的转膜液是1L体系里3.03gTris，14.4g甘氨酸，200mL甲醇，样本是2*loading抽提的，蛋白浓度还可以，Vegfr能做阳性对照吗？

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-7-8 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你整个WB流程是没有问题的,问题可以缩小为:
1,目的蛋白是否表达?
2,抗体是否工作?

whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-7-8 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的转膜液是1L体系里3.03gTris，14.4g甘氨酸，200mL甲醇，样本是2*loading抽提的，蛋白浓度还可以，Vegfr能做阳性对照吗？

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转膜缓冲液没有什么问题的。阳性对照的问题了

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