液质联用

我在做一个多肽的药物代谢试验。药物分子量4700左右。从血浆中提取后，色谱条件：Restek C18 guard column (2.1×12.5mm, 5 μm particle size) at 18 ℃. The LC elution conditions were as follows (all solvent percentages are volume fractions): mobile phase A, 0.1% FA in water; mobile phase B, 0.1% FA in ACN; time program, 0 min, 95% A/5% B; 1.0 min, 95% A/5% B; 5 min, 5% A/95% B; 5.5 min, 5% A/95% B; 6 min, 95% A/5% B; 12 min, 95% A/5% B; flow rate, 200 μl/min. The retention time is 9.26 min。 我的方法学验证达到标准。但是——

投稿后一个审稿人的意见：

A flow rate of 200 ul/min is appropriate for a column of this length. However, a gradient going from 5% organic to 95% organic in 4 minutes is not appropriate. A column that size simply cannot have reached any state of equilibrium whatsoever in that time. The authors then return the column rapidly to initial conditions by 6 minutes. Supposedly, the column is already re-equilibrating by the time the analyte comes off at 9.26 minutes. Clearly the LC separation is not really functioning as one would hope that it is. Clearly, something is happening in the column since their analyte is observed to come out, but chromatographically the assay is unsound and not in control.

这该如何解释呢??请各位指教

我基本上理解了审稿人的意思，主要是由于柱后延迟造成的：
按理说样品出峰应该在有机相比例升高或者最高时，而作者的出峰大概9.26min，从6min以后表面上看已经高水相了。其实最主要原因是柱后延迟。柱后延迟主要是由于分流阀（四元泵用来控制各相比较）或泵后（二元泵）到柱前的死体积造成的，一般来说，此死体积比较大，在使用梯度洗脱更换比较时，会造成比较改换滞后，尤其在小流速时会特别明显。例如在作者的实验中，有机相在5min中升高至最高，若此时柱后延迟，在200ul/min流速下比例要完全更换过来需较久，可能也会延迟三四分钟，因而造成较晚出峰。
其实应该在实验初期就发现此问题，改用孔径和内径较大的柱子高流速分离就可以了，而且估计时间也会省下来很多。像一般的亚微米柱或接近亚微米柱不太适合梯度也是这方面的原因。
您就适当的给审稿人解释一下吧，他太专业了。你最好是承认我们这边存在这样的问题，但方法确证和测定均OK，以后改正等类似话语。

貌似他的意思是说你的梯度对于这个流速来说变化太快了，你的样品出峰时间是在柱子重新平衡的过程中的，这个过程可能难以控制，所以我觉得，你应该把高有机相比例的时间延长，等到样品出峰后，在开始重新平衡柱子。

多谢2f 3f大哥

流速200ul/min对于这种长度的柱子比较适合。但是梯度变化在4分钟内从5%有机相变为95有机相是不合适的。该类型的柱子在这个时间内是不能达到任何的平衡状态。作者快速的在6分钟回到原始状态。可以断定，当样品在9.26分钟出峰时柱子已经得到再次平衡。很清楚LC分离不象人预期的那样工作。很清楚，柱子里发生了一些事因为他们的分析物可以观察到出来，但是从色谱角度看该检测不正确而且不好控制。

说你的梯度方式不正确，一般再平衡时间应该在样品出峰以后。所以你要改变梯度了。

多谢各位英雄！问题得到解决！