小中大抗坏血酸(维生素C)的测定方法
抗坏血酸(维生素C)的测定方法
在测定维生素C的国标方法中,荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法,2、4-二硝基苯肼法作为第二法。
一、荧光法
1.原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。
2.适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定
3.仪器
3.1.实验室常用设备。
3.2.荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
3.3.打碎机。
4.试剂
本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂。
(1)偏磷酸-乙酸液:称取15g偏磷酸,加入40ml冰乙酸及250ml水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至500ml。4℃冰箱可保存7~10天。
(2)0.15 mol/L硫酸:取10ml硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200ml。
(3)偏磷酸-乙酸-硫酸液:以0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同4.1.配制。
(4)50% 乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠(CH3COONa·3H2O),加水至1000ml。
(5)硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,溶于100ml乙酸钠溶液(4.4)中。临用前配制。
(6) 邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100ml。
(7) 0.04%百里酚蓝指示剂溶液:称取0.1g百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml。
变色范围:pH=1.2 红色
pH=2.8 黄色
pH>4.0 兰色
(8) 活性炭的活化:加200g炭粉于1L 1+9盐酸中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110~120℃烘箱中干燥,备用。
(9)标准
抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):准确称取50mg抗坏血酸,用溶液(4.1)溶于50ml容量瓶中,并稀释至刻度。
抗坏血酸标准使用液(100μg/ml): 取10ml抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值,如其pH>2.2时,则应用溶液(4.3)稀释。
标准曲线的制备:取下述"标准"溶液(抗坏血酸含量10μg/ml)0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列,取双份分别置于10ml带盖试管中,再用水补充至2.0ml。
5.操作步骤
5.1 样品制备
全部实验过程应避光。
称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或兰色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间,一般取20g匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml,过滤,滤液备用。
5.2 氧化处理:分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。
5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"标准"及"标准空白"。
5.4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"样品"及"样品空白"。
5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50ml,在4℃冰箱中放置2h,取出备用。
5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液,用水稀释至50ml,备用。
5.7 荧光反应
取" 标准空白"溶液,"样品空白"溶液及(5.6)中"样品"溶液各2ml,分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用。