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标题:【求助】双变量流式细胞仪的散点图解读

DCS[使用道具]
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【求助】双变量流式细胞仪的散点图解读


请专业人士耽误你几分钟帮我解答一个幼稚的问题,双变量流式细胞仪的散点图(Annexin VPI双染),每个象限到底代表什么?
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pulala[使用道具]
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我倾向于说法,坏死细胞的PS也是翻转的。
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iii_ii[使用道具]
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第二种说法是不对的,第一种也没有说清楚,严格来说,磷脂酰丝氨酸在活细胞中分布于细胞质膜内侧,在凋亡发生的早期阶段,会从质膜内侧翻转到外侧,从而可以被特异识别磷脂酰丝氨酸的蛋白Annexin V检测。由于Annexin V无法进入活细胞或者早期凋亡细胞(其细胞膜结构仍然保持比较完好状态),所以其检测到的阳性信号,主要是磷脂酰丝氨酸翻转导致的,因此可以反应凋亡的多少。坏死的细胞是不会发生PS外翻的,但由于晚期凋亡或者坏死的细胞,其细胞膜通透性完全找到破坏,Annexin V可以进入细胞,结合质膜内侧的磷脂酰丝氨酸。所以,为了区分这两种不同性质的结合,可以发挥PI不能通透早期凋亡细胞的特性,使用Annexin V和PI双染检测早期凋亡。
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一般认为,左下象限是活细胞,右下象限是凋亡细胞,右上象限是坏死细胞。
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89tongzijun[使用道具]
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严格来说,右上象限的判断依据应该如下:
1,当右下角没有早期凋亡细胞,而出现右上角细胞时,可以判断为坏死
2,当右下角出现许多早期凋亡细胞,而右上角也存在细胞分部时,右上角是晚期凋亡或者坏死。
因为凋亡是个连续的过程,早期凋亡的细胞经历了一段时间后,都会进入右上角晚期凋亡部分,这个时候和坏死(如果有的话)无法区分。所以对右上角最严格的定义是晚期凋亡或者坏死,但基于对细胞死亡的基本认识,出现上面讲的2这个情况,可以把右上角称为晚期凋亡。因此如果看到许多研究者计算凋亡比例时,也把这部分计算进去,不要奇怪:)
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89tongzijun[使用道具]
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细胞的转变是一个动态的过程,并没有一个明确的界线。
对于凋亡的认识也是一个动态发展的过程,现在其实也没有一个非常统一的认识。
有部分人认为,也包括我,将凋亡分为早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞本身就是不合适的。因为在体内,细胞发生凋亡之后不久很快就会被吞噬细胞吞噬清除,在体内凋亡细胞是没有机会发展到所谓的晚期阶段的!而对于早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的分类是基于体外诱导凋亡之后经过不同的时间段观察后得到的,经过较长处理后得到的细胞就被认为是晚期凋亡细胞,其实这只是在体外条件下人工诱导的细胞,在体内是不存在的,研究这种细胞是没有意义的。所以,现在,研究细胞凋亡诱导的时间一般不会太长,诱导的都是早期凋亡细胞(这种在体内状态下存在的具有意义的细胞就直接称为凋亡细胞),用Annexin V/PI染色法检测时位于右下象限,而位于右上象限的细胞就是坏死细胞(在体外诱导的这段时间内早期凋亡细胞还不会发展到所谓的晚期凋亡细胞)。而且,研究晚期凋亡细胞和坏死细胞时也发现它们之间有很多共同点,相互之间区别起来也不是很容易的。
所以,识图时要结合实验过程中凋亡诱导的时间,时间短的,还没有晚期凋亡细胞的,那右上象限的细胞就是坏死细胞;如果凋亡诱导的时间较长的,那右上象限的细胞就是坏死细胞和晚期凋亡细胞。但是,在此我建议大家诱导凋亡细胞或者研究凋亡时,注意诱导的时间,研究在体内不存在的所谓的晚期凋亡细胞时要慎重考虑。
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89tongzijun[使用道具]
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回复 #7 kent 的帖子

非常高兴能够和你交流,其实我并不是研究细胞凋亡的,只是曾经关注过细胞凋亡,而且经常使用流式细胞术,曾总结过流式检测细胞凋亡。我想你善长于从组织化学或者形态学的角度去认识细胞凋亡,而我则习惯于从流式检测的角度去认识细胞凋亡,我们认识事物的角度不一样,对于事物的认识也会不一样。这很正常,更何况,对于细胞凋亡的认识国际上也没有完全统一。
1、你对于坏死细胞AV阳性的原因的解释(坏死细胞细胞膜通透性增加),我以前没有认识到,我觉得你的解释很有道理,非常感谢你让我认识到了这一点。但是,我认为坏死细胞已经失去了活性,其细胞膜也失去了活性,最主要的表现是通透性增加了,那么坏死细胞还能够维持细胞膜PS的极性吗?我认为维持PS的极性也需要能量的,坏死细胞的细胞膜已经失去了活性,就无法维持PS的极性,PS也应该有部分翻转到细胞外。AV就能够直接结合坏死细胞表面的PS了。我不知道我的观点是否正确,如果你看到过坏死细胞的PS不会翻转的证据,是否可以提供?
2、我还是坚持体内是没有晚期凋亡细胞的。因为被吞噬的凋亡细胞已经在吞噬细胞之内,被吞噬细胞吞噬的凋亡细胞还能算是细胞吗?虽然我们还能看到被吞噬细胞吞噬的凋亡细胞,但是此时再去研究这个凋亡细胞的功能已经没有意义了,此时应该将目光聚焦到吞噬细胞,研究吞噬细胞吞噬凋亡细胞之后会发生哪些变化,有什么意义?
3、我承认在体外新诱导的凋亡细胞经过一段时间之后的确会发生变化,变成所谓的体外的晚期凋亡细胞。但是我们要知道体外实验的目的就是为了模拟和简化体内环境,体外实验是否有意义的重要标准就是在体内是否会发生。我想一个在体内不存在的只是在体外人工诱导的细胞,对其进行研究是没有大的意义的。
4、细胞坏死在体内可能发生率不是很高,但是在体外的培养条件下发生率是很高的,即便你培养的条件控制的如何的好,你操作是如何的小心,体外实验时你是不可能保证你的活细胞的比例达到100%的。所以,在做体外实验时我们要尽可能的想办法保持细胞的活力,减少死细胞的发生,检测时也尽量缩小死细胞的影响。在检测细胞凋亡时,之所以还需要用PI染料,就是因为不管哪种方法诱导细胞凋亡,坏死细胞是不可避免的,为了去除坏死细胞对于凋亡细胞统计的影响,所以加用PI染料,将坏死细胞从诱导的凋亡细胞中排除出去。
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借问达人,左上象限是否有意义呢?一次实验中两个药物处理组细胞的左上象限达到40%,什么原因呢?
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89tongzijun[使用道具]
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请问你的左上象限是指PI阳性而AV阴性的细胞吗?
PI阳性而AV阴性的达到40%,你的结果有点问题。请具体说明其他象限的比例以及做的具体实验内容!
另外,需要注意的是,你流式分析时补偿是否有正确调节也是很有影响的。
如果可以,请上传你的流式图。
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89tongzijun[使用道具]
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PI标记坏死细胞的证据:……This PANX1-dependent membrane permeability was selective, as these early-apoptotic cells did not take up the dye propidium iodide (which marks necrotic cells; data not shown).……
……f, Left,YO-PRO-1 uptake by primary murine thymocytes undergoing anti-Fas induced apoptosis, with zVAD or CBX treatments. Right, percentage of apoptotic cells (annexin V positive and propidium iodide negative). n52. Error bars represent s.d., except in c (s.e.m.).……
摘自文献:Nature 2010 Oct; 467(7317):863-7.Pannexin 1 channels mediate 'find-me' signal release and membrane permeability during apoptosis.文章第2页。
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