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标题:【求助】人外周血单核细胞的分离、培养

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】人外周血单核细胞的分离、培养


马上要进行人外周血单核细胞方面的实验了，我对这一块知之甚少，所以从今天开始我立贴在此，希望得到各位前辈的指导与帮助！实验的每一步我都会提出我的疑问，希望大家不吝赐教，各位的经验、教训都是指引我前行的明灯！
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
贫血
第一问：
用于分离单核细胞的外周血能否储存备用？怎么储存？会不会影响单核细胞活性，因为我分离的细胞是用来培养的。
我没分离过单核细胞，估计要反复多次才能成功，总不能总是拿针管抽自己的血吧？
我能否一次取血几百毫升储存备用？（我本人贫血，想联系血站购买）
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发表于 2014-8-2 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我只做过单核细胞的分离，本来以前也是想培养这个细胞的，但是相关资料比较少，而且据说很难养，放弃了。
你可以先取一些废血，譬如去检验科拿一些不要的血练练手，因为步骤虽然不复杂，但是还是要一定的技巧的。
储存过的血液活性肯定是不如新鲜血液的，尽量早一点做后面的。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢楼上，我本来想抽大鼠的血练手，没想起去检验科搜集剩血，看来在这里发帖求助是明智的，谢谢了。
另外，其他站友谁做过储存血液的单核细胞分离培养？如果血库储存的全血单核细胞活性不好，输注给病人岂不是有害无益？全血的储存需要哪些条件？希望指教，谢谢。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过一两次,是用FICOLL液分离的很简单,将血液放如FICOLL液中,离心,吸出中间曾的单核细胞,具体的步骤你可以查一下,
顺便说一下,血库存的是红细胞,血浆,血小板,全血等.不会考虑单核细胞的活性的.不需要单核细胞的活性.
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

淋巴细胞是这样分离的：
1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。
2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）
3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。
4、将上层淡黄色的稀释血浆取出于洁净试管中-20℃保存。
5、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2~5mlHank’s液的离心管中，混匀。
6、室温下,1500rpm离心10min。
7、弃上清，重复洗涤一次。用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细胞悬液至所需浓度：一般每ml血可分离出1~2×106个单个核细胞。


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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好的，如果如楼上所说，看来不能买一袋血储存备用了，感谢指点。
楼上说的正是我下面想问的，因为我没接触过，所以问的可能比较细，比较低级：
第二问：
采血时抗凝用的肝素具体是哪种肝素？医院科室里用的低分子肝素钠可以吗？你们是从哪里获得的，怎么做到100u/ml，剂量要求很严格吗？
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wu11998866[使用道具]
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 小中大

呵呵
我以前直接用科室含肝素钠的试管取的血样，这个好像护士都比较清楚，一般一个管子取2~4ml吧，这个剂量要求并不那么严格，只要血液没凝固就好。血取太多了的话抗凝效果就不好了，血取少了呢获得的单核细胞也少了增加实验的难度。
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dragonkilly[使用道具]
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 小中大

有道理，这个问题我也解决了，科里采血化验的管管里都有抗凝剂，只不过是柠檬酸钠，护士说也可以用肝素，她们也有。对护士越来越有好感了，呵呵。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-8-2 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

人外周血单核细胞的体外培养需要加入什么生长因子吗？只用含10%新生牛血清的1640外加双抗、谷氨酰胺可以吗？
另外检验科的血化验之后剩余的标本一般都是要保存一周的，以备结果受到怀疑是再次化验，不知道能不能要的到。
其他还有没有什么好办法呢？
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