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碘、淀粉比色法测定血清淀粉酶

关键词：国家二级标准物质  农药残留检测  有机标准样品  烟煤标准物质
  【实验原理】
  血清(或血浆)中α-淀粉酶(amylase，AMY)催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推算出淀粉酶的活力单位。
  【试剂与器材】
  1．0．4g／L缓冲淀粉溶液   约500ml蒸馏水中，溶解氯化钠9g，无水磷酸氢二钠22．6g(或Na2HPO4·12H2O  56．94g)和磷酸二氢钾12．5g，加热至沸腾，另取一小烧杯，精确称取可溶性淀粉0．4g，加入蒸馏水约10ml，使溶液呈糊状后，加入上述沸腾的溶液中，冷至室温，加370%甲醛溶液5ml，蒸馏水稀释至1000ml，该溶液pH为7．0±0．1，4℃冰箱保存。
    2．0．1mol/L碘贮存液  碘酸钾1．7835g、碘化钾22．5g，溶于约400ml蒸馏水中，缓慢加入浓盐酸4．5ml，边加边搅拌，蒸馏水定容至500ml，充分混匀，贮存于棕色瓶中，塞紧，4℃冰箱保存。
    3．0．0lmol/L碘应用液  碘贮存液l份加蒸馏水9份混匀，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱中可稳定1个月。
  【操作步骤】
    血清先用生理盐水做10倍稀释，按表操作
混匀，蒸馏水调零，波长660nm下，读取各管吸光度。
    AMY活性单位定义：100ml血清中的淀粉酶，在37℃15分钟水解淀粉5mg为1个单位。
【结果计算】
  淀粉酶（U）=（A空白管—A测定管）/A空白管×0.4/5×15/7.5×100/0.02=（A空白管—A测定管）/A空白管×800
  【参考区间】
  血清：80～180U；尿液：100～1200U。
  【临床意义】
  1．淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌，可通过肾小球滤过。流行性腮腺炎，特别是急性胰腺炎时，血和尿中的AMY显著增高：发病后8～12小时血清AMY开始增高，12～24小时达高峰，2～5天下降至正常。达350U时应怀疑此病，若超过500U则意义更大。尿AMY于发病后12～24小时开始升高，下降比血清AMY慢，在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后等均可见血清AMY增高，但常低于500U。
   2．正常人血清中AMY主要由肝脏生成，若血清与尿中AMY同时降低，提示肝炎、肝硬化、肝癌及急、慢性胆囊炎等。肾功能障碍时，血清AMY也可降低。
   【注意事项】
    1．酶活性<400U时，与底物的水解量呈线性。若测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应增大血清稀释倍数或减少稀释血清加入量后重新测定，测定结果乘以稀释倍数。
    2．除肝素外，草酸盐、枸橼酸盐、EDTA-Na2及NaF等抗凝剂对AMY活性有抑制作用。
    3．唾液含高浓度淀粉酶，在采集标本和实验过程中应防止唾液污染。
    4．淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差异，但一般应在0．40以上。
    5．缓冲淀粉溶液中若出现混浊或絮状物，表示其已受污染或变质，需重新配制。碘应用液需避光保存。
    6．本方法亦适用于其他体液淀粉酶的测定。尿液标本应做20倍稀释后测定，十二指肠液或胰液需稀释100倍后测定。
    7．加入碘及蒸馏水后应立即比色，否则可使结果偏高。
    【评价与思考】
    本方法线性范围<400U，批内CV 3．1％～9．0％，批问CV 12．4％～15．1％。本方法简单、快速、灵敏，试剂成本低廉；但试剂易变而缺乏稳定性、标本稀释倍数过大等因素使其准确性较差。与对一硝基苯麦芽庚糖苷法相比较，在酶活性低时相关性较好，但酶活性较高时相关性差，因此，本方法不被认为是淀粉酶测定的理想方法。但由于方法简单、不需特殊设备，目前仍在我国应用。