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标题:【转帖】【分享帖】浅谈“用于重组抗体药物生产的细胞...

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 小中大

【转帖】【分享帖】浅谈“用于重组抗体药物生产的细胞...

下文是楼主从事细胞培养五年来的工作经验，学习体会。
目前，多种表达系统均可实现重组抗体的异源表达，但是抗体药物的产业化制备，始终以动物细胞大规模培养工艺为主。1986年首个治疗性抗体OKT3TM上市之初，动物细胞表达水平普遍不足100mg/L。经过近三十年间发展，业内用于重组抗体生产的动物细胞培养工艺，无论细胞培养密度，还是抗体表达水平均提高五十倍以上。流加培养工艺中细胞密度可达1~2×107 cell/mL，日均产量200mg/L/day以上（最高可达700mg/L/D），最终收液的容积产率可达3-5g/L（最高达13g/L），培养体积可至20，000L（Lonza, Portsmouth/NH—facility）；灌注培养工艺中细胞密度可达2×108cell/ml，抗体容积产率最高达25~40g/L（Percivia公司XD?灌注系统）。以上行业技术水平的飞速提升，既源于上游细胞系构建技术的突破，也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开发，工艺优化，结合新型生物反应器的使用，实现了动物细胞的高密度、高表达培养，满足了临床上对于抗体药物“公斤级”产能的需求。
动物细胞的体外培养，涉及生物反应器的物理参数（温度、pH、DO、DCO2等）、培养基的营养成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等）的消耗，以及自身代谢产物（乳酸、氨、重组蛋白等）的积累与生理生化参数（细胞密度、活性，能荷等）的变化。作为重组抗体生产的“细胞工厂”，上述过程参数的改变会直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。比如：当乳酸（58 mM）、渗透压（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）参数超过其相应的阈值，细胞活性和抗体产量均会明显下降。目前，业内已经对于细胞培养过程参数进行了深入的研究，在动物细胞大规模培养中下述参数的控制也已成定式
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 小中大

下面谈下常用两种培养工艺的应用及工艺优化思路
流加培养方式及优化策略
目前上市的重组抗体中绝大多数（如：EnbrelTM、HerceptinTM、RituxanTM、SynagisTM）是采用流加（Fed batch）培养工艺生产，这主要由于与之配套的生物反应器（搅拌罐、气升罐等）制造成熟，可线形放大（最大至20,000L），操作简单等原因。但是，流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题。因此，流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上，其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养基，用于补充易耗成分，降低副产物积累。
灌注培养方式及优化策略
灌注培养模式（Prefusion）下，反应器几乎可实现“恒化器”培养效果，细胞密度、蛋白产量可较流加模式提高数倍。但是灌注培养细胞截留需特殊装置，工艺放大存在难度，其产业化应用的经济性尚存争议。目前，只有少数抗体（如：ReoProTM、RemicadeTM、SimulectTM、SimponiTM、StelaraTM等）及易降解的重组蛋白（凝血因子）等使用该工艺。灌注培养工艺优化，主要集中在灌注培养基及灌流速度上。其优化原则是通过降低灌流速度，提高培养基的利用率和产物的容积产率。
此外，控制流加灌注工艺（controlled fed prefusion）同时具有流加工艺和灌注工艺的优点。该工艺对易产生代谢废物的营养进行限制性流加。根据细胞摄氧量的变化，流加氨基酸以满足高密度细胞的营养需求。
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 小中大

小型化反应器在工艺开发中应用
动物细胞的高密度培养，有赖于合适的培养基以及适宜的反应器环境。因此，旨在提高重组抗体表达的工艺开发，主要集中在“个性化培养基”的开发以及过程参数的优化上。上述研究通常需要借助小型化反应器，如传统的三角瓶、孔板，转管（spintube）等。近年，新型自动化小规模反应器（BioLectorTM、SimCellTM、Micro-24TM,ambrTM等）不断出现，此类装备不仅能模拟反应器的pH、DO、培养基流加等控制条件，而且能够实现试验条件的通量筛选，大大加速了细胞培养工艺开发的进程。如： SimcellTM可同时使用180个微型反应器（650ul）进行工艺条件筛选。Micro-24TM可在孔板规模（5ml）对3L反应器pH，DO，温度等不同条件进行模拟。
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发表于 2014-8-7 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面是自己总结的培养基优化策略与方法：
哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，如： NS0细胞的生长依赖于外源性胆固醇，杂交瘤细胞、CHO细胞多为谷氨酰胺营养缺陷型。此外，即使基于同一宿主细胞所构建的的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调“个性化培养基”的概念，即：生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。下述方法在用于培养优化均有提高重组抗体表达的报道。

[ 本帖最后由 uaubc 于 2014-8-7 16:04 编辑 ]
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 小中大
组分滴定法
组分滴定法（Component titration）是通过设计培养基组分的浓度梯度，来确定其最优浓度。由于动物细胞用培养基成分复杂（常含有70种组分以上），且存在“协同效应”。所以，该方法只适用优化培养中的个别组分（如胰岛素、水解物、生长因子等）。

[ 本帖最后由 uaubc 于 2014-8-7 16:04 编辑 ]
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 小中大
培养基混合法
培养基混合法（Media blending）是通过对成分已知的原型培养基进行不同比例混合。助DOE（Experiment design expert）软件进行试验设计与分析，快速确定最优培养基配方。目前市售培养基优化试剂盒均是据此原理。

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 小中大
消耗组分分
消耗组分分析法（Spent media analysis），通过对批式培养过程中各组分的消耗情况进行分析，及时补充易消耗组分，调整流加策略。该方法由于检测手段所限，主要用于葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等组分的优化。

[ 本帖最后由 uaubc 于 2014-8-7 16:04 编辑 ]
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 小中大
化学计量分析法
化学计量分析法（Stoichiometric Analysis）利用简化的数学模型，建立葡萄糖、氨基酸，维生素与细胞生物量与重组蛋白合成，以及能量代谢之间化学计量关系。据此进行初始培养基、流加培养基以及流加策略优化，可减少乳酸、氨的生产，该方法在上世纪九十年代提高重组抗体产量至2.4g/L

[ 本帖最后由 uaubc 于 2014-8-7 16:05 编辑 ]
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 小中大
理性培养基设计法
理性培养基设计（Rational Culture MediaDesign），综合上述三种培养基优化方法。先对大量培养基候选物及混合配方进行筛选，利用最初确定的基础培养基进行批式培养，分析培养基中易消耗组分，据此设计流加培养基和流加策略。最后，利用组分滴定法确定流加培养基其他添加物（水解物）的最适浓度。最后，优化过的基础培养基、流加培养基及补料策略，在迷你反应器上进行验证。这也是大多数CRO公司（Sigma、BD等）开发定制培养基的主要方法。

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 小中大
系统培养基开发法
系统培养基开发（SystematicApproaches），是将培养基成分分为氨基酸、维生素、核苷酸等若干组，首先判定对细胞表达影响较为显著的组别，再针对该组别进行重点的成分优化。
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