【转载】【分享帖】用于重组抗体生产的细胞系构建技术

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标题:【转载】【分享帖】用于重组抗体生产的细胞系构建技术

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发表于 2014-8-9 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

笔者根据自己的工作经验和学习心得，将用于重组抗体生产的细胞系构建技术总结如下，欢迎同行拍砖！
开篇语
构建生产细胞系是重组抗体产业化制备的第一步。目前国际上用于重组抗体生产的工程细胞系表达水平可达20-70pcd。多种动物细胞细胞（如CHO、NS0,SP2/0等）根据其特性的不同，在抗体药物生产中有着不同的应用实例。近年来，工程细胞系的构建技术发展主要集中在以下三个方面：利用细胞工程技术提高宿主的生长、表达能力，新型载体功能元件和定点整合技术克服载体随机整合时发生的“位置效应”，以及应用流式细胞分选术和高通量筛选机器提高了重组细胞的筛选通量和效率。

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发表于 2014-8-9 17:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用于抗体生产的工程细胞系构建流程
抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达又遵循着“分泌蛋白”的一般规律：全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。已上市抗体的临床研究也表明，宿主细胞对重组抗体的“翻译后修饰”，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性。
在常用的异源蛋白表达系统中：大肠杆菌不适合全抗体分子，只能表达单链抗体或者抗体片段；酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物等由于缺乏翻译后修饰能力，其所表达的重组抗体与人天然抗体存在着显著的质量差异。只有哺乳动物细胞适宜重组抗体的异源表达。因此，目前已上市的治疗性抗体中，除了少数抗体片段（如：LucentisTM）外，均由哺乳动物细胞生产。
用于抗体药物生产的宿主细胞
哺乳动物细胞中，CHO、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、PerC.6、HEK293等均有用于重组抗体生产的实例，这其中CHO、NS0及sp2/0细胞由于具备相对成熟“平台化开发技术”应用较为广泛。上述动物细胞由于其生长、代谢特性的不同，对重组抗体的表达、修饰能力也不尽相同

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小中大

“工程细胞”的概念与构建流程
用于抗体药物生产的工程细胞系需具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高（1~2×107cell/ml）；异源蛋白表达能力强（20~70 PCD），具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系遗传背景清晰、表型稳定，符合相关法规要求。
目前，业内细胞系构建中常用的筛选体系为“Dhfr-”和“GS”系统，基于此技术的工程细胞构建流程如下：携带有目的基因和筛选标记（Dhfr、GS，或其他抗性基因neo、hygro）的质粒转染至宿主细胞后，使用相应的条件培养基筛选出重组细胞。为提高重组细胞的表达水平，可采用加压多轮筛选的策略，增加目的基因拷贝数。初筛得到的候选克隆，经悬浮、无血清驯化后，在反应器中对其生长能力、表达水平，产物质量综合评价，选择具有产业价值的细胞系冻存。最终，建立符合cGMP要求的主细胞库、工作细胞库。

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发表于 2014-8-9 17:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

高表达载体的构建与优化
在用于抗体的表达的载体构建过程中，目的基因的简化、轻重链比例优化，顺式作用元件的应用等，都能提高重组抗体的表达水平。这其中载体的构建策略与载体的功能元件，对于细胞的表达能力、遗传稳定性影响最为显著，也是此领域研究的热点。
3.1用于全抗体表达的载体构建策略
生物合成四聚体IgG结构，需要协调表达抗体分子的轻链、重链基因。以下三种载体构建策略均有用于抗体表达的报道
单顺反子（mon-cistronic）载体
轻链、重链基因分别使用不同的载体，共转染至宿主细胞。该策略对质粒要求不高，且转染效率较高，是表达重组抗体最为常用的载体构建策略。也可将轻链基因、重链基因串联到同一载体，分别使用各自的启动子、终止子转录翻译，该方法理论上可实现轻链、重链基因的等摩尔表达。
双顺反子（bi-cistronic）载体
在载体构建中使用核糖体内部进入位点，在其两端串联轻链、重链基因，可实现轻、重链基因同时转录。也可在载体中使用2A肽结构，在同一阅读框架内表达氢、重链基因。
反式互补（trans-complementing）载体
表达轻链、重链的两个载体分别含有编码筛选标记DHFR基因的不同序列。只有当含有轻链、重链的两个载体同时转染至宿主细胞时，筛选标记DHFR才能正确表达。以此提高重组细胞的筛选效率。

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发表于 2014-8-9 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

载体功能元件的最新进展
常用的表达载体依靠随机整合至宿主基因组中来表达目的基因。整合位点的“位置效应”往往会造成目的基因的低表达或沉默。近年，出现的多种商品化的染色质开放原件（STAR?、EASE?、UCOEs?、MARs? 等），人工染色体（ACE ?）、逆转录病毒载体（GPEx?），定点整合技术（Flp‐In?、RMCETM、CompoZrTM等）等，能够克服上述随机整合的缺点。载体构建中引入这些功能元件，可大幅提高高表达克隆的比例，缩短工程细胞系的构建周期。
大规模瞬时转染技术的发展
瞬时转染技术由于目的基因不需要整合到宿主的基因组中，基因拷贝数和转染效率均较稳定转染明显提高。该技术可短时间内内可积累mg~g级的样品，更适用于抗体药物研发的早期阶段。随着大规模瞬时转染技术的发展，瞬时转染的最大生产规模为100L。瞬时转染的大规模培养工艺中对质粒需求量很大（1~1.25ug/ml）。由于其工艺复杂、成本较高等原因，限制了该技术在抗体药物的产业化生产中的应用。
克隆筛选技术的发展趋势
克隆筛选环节需要筛选出重组细胞并将其单克隆化，传统的有限稀释法耗时、费力，筛选通量低，往往是稳定细胞系构建的限速步骤。近年来，在克隆筛选手段上出现了标记高表达克隆和高通量筛选机器等技术。借助流式细胞仪进行细胞分选，或使用自动机器挑选克隆，都能显著提高克隆筛选的通量和效率。此外，在克隆筛选策略上，利用微型反应器和毛细管电泳技术，可以在克隆筛选环节，对细胞系的表达水平、生长能力，产物质量进行综合评价。这样就避免了单纯以目的蛋白表达量为依据，忽视候选克隆细胞系在反应器中的表现、产物质量等问题。

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小中大

展望
上世纪九十年代发展起来“基因共扩增”技术，已经在稳定细胞系构建中得到广泛的应用。但是，在此后的产业化实践发现，基于此原理的的Dhfr、GS表达系统普遍存在着重组克隆差异性大、表型稳定性差等问题。通过对重组细胞的目的基因拷贝数、mRNA、基因整合位点进一步发现：重组抗体的表达水平与基因拷贝数并不总是正相关。过多的外源基因拷贝数会导致重组细胞代谢负荷加大，生长能力减弱。此外，基因插入位点的“位置效应”，宿主的转录、翻译能力，也会影响重组抗体的表达水平。目前，最新的克隆筛选策略开始尝试以轻、重链mRNA水平为指标，预估重组细胞的表达水平、质量差异[
此外，近年来对高产细胞系的转录组、蛋白组、代谢组的研究发现：重组细胞表达异源蛋白能力的高低，不能简单的归结为若干个关键基因的作用。成就一株高产细胞系，往往是细胞的能量代谢、氧化还原电位、生长能力，蛋白加工能力等诸多特性，以网络的形式综合作用的结果。对高产细胞的组学研究，加深了业内对动物细胞表达异源蛋白机制的认识，可以预见：组学技术的前瞻性指引，结合宿主细胞遗传改造，和高通量筛选技术的应用，将是未来高产细胞系构建工作的发展方向。

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小中大

谢谢分享。。。
如果要在sp2/0表达完整的抗体分子，而手头上的质粒是轻重链分开的两个质粒，是是不是要共转到sp2/0中？
这样分开表达的轻重链能很好的组装成一个有活性的抗体分子吗？而且可以分泌到胞外吗？

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小中大

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2014-8-9 17:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢分享。。。
如果要在sp2/0表达完整的抗体分子，而手头上的质粒是轻重链分开的两个质粒，是是不是要共转到sp2/0中？
这样分开表达的轻重链能很好的组装成一个有活性的抗体分子吗？而且可以分泌到胞外吗？ ...

只做过CHO共转染，不过感觉宿主换成SP2/0效果应该一样
轻重链连载两个载体上，等摩尔或其他比例（需要优化），电转到宿主中，加压筛选理论上应该拿到分泌至胞外的IgG.

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小中大

CHO-S有没有用过，单质粒