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标题:【求助】在纯化过程中哪一步能大量除去内毒素？

六个梦[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】在纯化过程中哪一步能大量除去内毒素？


单抗三步纯化：Mabslect Sure、阳离子交换、capto adhere，内毒素检测一直不合格。想请教各位前辈其中那步能大量去除内毒素，操作中有哪些注意点？谢谢！
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的，不够详细，比如阳离子层析，内毒素一般都存在于穿透液中，不会和填料吸附。但不知道楼主的工艺中，阳离子层析收集的是穿透还是洗脱
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biabiade[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
单抗三步纯化：Mabslect Sure、阳离子交换、capto adhere，内毒素检测一直不合格。想请教各位前辈其中那步能大量去除内毒素，操作中有哪些注意点？谢谢！

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记得之前看到原研药欧盟生产工艺的介绍，应该是protein A和阴离子交换
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六个梦[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一步亲和洗脱用pH3.8的柠檬酸缓冲液，阳离子收集洗脱液，离子梯度洗脱，最后过Capto adhere。要求内毒素低于10EU/剂量，但我们几乎每次都超标很多，有时高达12EU/mg。缓冲液内毒素为0.03EU/ml
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zbboom[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，应该说，每一步都能有效去除大部分内毒素。
2，哺乳动物细胞的发酵产物，内毒素水平本就不高；但抗体蛋白量很大，控制每剂量内毒素是有难度。但是12EU/mg，这个也太高了！！ ！
3，起始缓冲液合格，注意操作过程中的外源内毒素引入。
4，你应该检测每步骤前后的样品总内毒素水平（eu/ml，总体积），不要做到最后才测一下eu/mg。
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发表于 2014-8-9 23:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GE的技术支持那边应该也能提供些参考意见吧。
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阳离子的流穿会去除大部分的内毒素，收集洗脱液的话应该没有问题。不过梯度洗脱，放大会比较麻烦吧。可以再优化下。同意楼上的观点，注意外源引入的内毒素。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阳离子可以穿透内毒素，阴离子一般可以吸附内毒素，因为内毒素等电点较低。adhere 中就有阴离子交换基团，也会吸附内毒素。同意楼上所说，抗体表达不应该有这么多内毒素，注意环境和操作过程的控制吧
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-8-9 23:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实在没辙了就过一步Q层析，或专门去内毒素的填料
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发表于 2014-8-9 23:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你的蛋白是怎样的，一般低电导偏碱性pH下，用阴离子的流穿模式去除内毒素的效果非常好的。一般我们的样品经过这一步后，内毒素都及格。阳离子的结合模式也能较多的去除内毒素，但是比较关键的是你每步所用的器具都应该去内毒处理（包括称量试剂的）（干热或者碱处理）。你们内毒检测是怎样的？一般我们的检测缓冲液是检测不出来的，要是缓冲液都能检测出来，一般就是操作过程污染了，控好这些内毒基本就没问题了。
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