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标题:【求助】T4 DNA Ligase 连接时间

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】T4 DNA Ligase 连接时间

我用T4 DNA 连接酶将4Kb多的片段连接在T载体上，挑十几个样最后酶切只有一个是正确的，之前做过比这个小一半的片段，转化效率很高，请大家帮忙指导一下，为什么假阳性这么多，是不是连接时间过长（我每次都是晚上做上，第二天晚上做转化，差不多连一整天）
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上正解。T载体确实会产生很多假阳性，纠结于此于事无补。
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bhka[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4℃连接过夜，想效果更好再16℃连2-4h。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用16度连接过夜，也还行
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2014-8-27 10:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。



我当然是没有耽误后续的实验了，只是出现问题总要分析一下原因吧
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bhka 于 2014-8-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。 ...

我用的是Promega的pGEM-T easy vector，小片段挺好的，大片段就很不好用了
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-8-27 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 summerxx 于 2014-8-27 10:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。

我连的时间挺长了，都快一整天了
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