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标题:【求助】请教含内含子基因的扩增

douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教含内含子基因的扩增


想从一真核生物中扩增一个已知基因的编码区，不过此基因含有一个内含子，如果不去扩增cDNA而是通过设计引物进行多轮的pcr，从基因组中进行扩增，理论上可行，但实际上有螺友实践过吗？感谢
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，你还是先做反转录的好，这样的结果最真实！
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youreyes[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

若此基因的外显子和内含子已确定，你可分段扩外显子，然后经比对后把外显子连在一起即可。
我就是这么做的
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nikonun[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的两个外显子多长呢？你可分开扩增两个外显子，然后经过和已知序列的情况进行比对，结合GT-AG法则即可判断你的外显子区，连在一起即可
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要扩编码区，当然还是要用CDNA，如果想得到内含子的序列，再用基因组DNA
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douding66[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我准备用重叠延伸PCR扩增2个外显子，进行2次扩增后得到拼接的编码框
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这样做可以的，我做过。重叠14个以上即可，不放心就再长些。
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TNT[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般overlap PCR要求还是20个碱基以上的重复会比较好些，楼主为什么不用CDNA而一定要用DNA呢？费解
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dodoit[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不想提RNA贝，提RNA比较麻烦。
只有一个内含子的话可以采用overlap的方式比较简单
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baidukk[使用道具]
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发表于 2014-8-30 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问overlap是什么意思啊
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