PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 22  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱

she[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72165
精华 0
积分 242
帖子 184
信誉分 100
可用分 1731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
1

发表于 2014-8-30 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱

我以前用taq酶做pcr，条带挺亮的，现在用EX taq酶做条带特别暗，有的时候还扩不出来，我把模板亮加到5微没有太大改变，我的体系是引物1
+1，buffer 2.5，dntp0.5，,1.5,2都做过，酶0.3，模板3和5都做过，感觉变化不大
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
2

发表于 2014-8-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
模板量有时侯太大，PCR扩增会出不来，降低模板量试试。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
3

发表于 2014-8-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EXTaq不太好PCR扩增，你试一试加入少量Taq与EXTaq混合做一下。
顶部
yueban-1147[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75776
精华 0
积分 692
帖子 1064
信誉分 100
可用分 6113
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
4

发表于 2014-8-30 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

extaq酶的反应条件是不是要求比较高啊
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
5

发表于 2014-8-30 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

3. 你的体系是体积，各成分的浓度是多大？

4. Extag还是相对容易扩出来的，扩增能力和你说的tag我觉得差不多，都是tag，就是保真性又提高了一点
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
6

发表于 2014-8-30 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是做PCR中常见的问题，每个PCR体系中各组分之间都有一定的比例，与此同时最为关键的酶有没有问题，同实验室的可以相互借用一下试剂再做一次PCR对比一下。
顶部
xiaoxiaoniao[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 108878
精华 0
积分 509
帖子 677
信誉分 100
可用分 4049
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
7

发表于 2014-8-30 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也在用EX Taq鉴定重组DNA，感觉还是挺好出的，我的反应体系是50μl的

EX Taq Buffer  5
2.5mM dNTP   4
10mM 引物1   1.5
10mM 引物2   1.5
EX Taq           0.2
模版              100ng左右
水                 X

反应条件
1， 94度   2min
2， 94度   30sec
3， 50度   30sec
4， 72度   kb／min（根据自己的片段长短）
2～4 重复30～35次
5， 72度   1min

不知道对你有帮助没。。。
顶部
redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
8

发表于 2014-8-30 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也在用EX Taq鉴定重组DNA，感觉还是挺好出的，我的反应体系是50μl的

EX Taq Buffer  5

===========================================================

请问 Ex taq酶和LA taq酶有啥区别啊？与普通PCR所用的taq酶有啥区别啊？谢谢
顶部
she[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72165
精华 0
积分 242
帖子 184
信誉分 100
可用分 1731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
9

发表于 2014-8-30 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

===============================================

是CDNA，模板我做过梯度，2,4,5微全做了，但是没有太大变化
顶部
she[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72165
精华 0
积分 242
帖子 184
信誉分 100
可用分 1731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
10

发表于 2014-8-30 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2014-8-30 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

3. 你的体系是体积，各成分的浓度是多大？

4. Extag还是相对容易扩出来的，扩增能力和你说的tag我觉得差不多，都是tag，就是保真性 ...

是CDNA，模板我做过梯度，2,4,5微全做了，但是没有太大变化
顶部
 22  1/3 123››