【求助】细胞固定的问题

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标题:【求助】细胞固定的问题

tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做流式细胞分析时，对细胞的固定有比较高的要求：（1）要尽可能保持细胞的本来形态，有较为稳定的FSC和SSC。（2）要尽量避免细胞的自发荧光过强。我发现用多聚甲醛、戊二醛、甲醛、乙醇等固定都不能满足要求。在负80度条件下的甲醇固定可以有较好的效果，可是大量样品时难以保持负80度条件，所以只能小量做。（3）要尽可能不破坏细胞的表面抗原决定族。（4）不要对PI、EB等对DNA的染色造成影响。我发现多聚甲醛固定的细胞FSC和SSC较为稳定，可却可影响PI与DNA的结合，导致细胞核荧光信号强度的大幅下降。

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做表面抗原时，一般并不需要固定，直接活细胞做就可以呀。即使固定，可用1%多聚甲醛后固定即可（PBS配），影响并不是很大的。若固定后效果的确不好做细胞周期用70%乙醇可长期固定，我做过很好的，protocol放在protocols and tips中，我做的时候CV<10%，各个峰非常清晰。另外，PI染色可以放在多聚甲醛固定之前，而不能之后，但乙醇固定影响则不大。

tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，谢谢你的解答。请问你是否有固定红细胞的经验？如果用多聚甲醛固定，多长时间可以获得理想效果？

tuomu45[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的关于细胞固定的问题只有一个人关过，但这个问题一直都没得到好的解决，我现在很想得到一种能在常温下固定细胞的好方法，谁有好主意

kswl870[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做免疫组化的时候将包被的盖玻片放在六孔板内培养，之后用丙酮固定细胞的时候，会把六孔板上的塑料也会溶下来，这样会把盖玻片弄得很脏，请问该怎么处理啊，或者换成什么其他的固定方法好啊， btw;我养的是HUVEC啊

moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉着常温下还是丙酮比较固定细胞比较好了！

linlinstar[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用Chamber Slide，它和6孔板很相似，只不过板换成了载勃片，孔变成了格栏粘在载玻片上。这样可以直接在载玻片上培养细胞，让附壁细胞长在载玻片上。而不是长在盖玻片上。细胞当然可以用丙酮固定了。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做免疫组化的时候将包被的盖玻片放在六孔板内培养，之后用丙酮固定细胞的时候，会把六孔板上的塑料也会溶下来，这样会把盖玻片弄得很脏，请问该怎么处理啊，或者换成什么其他的固定方法好啊， btw;我养的是HUVEC啊
我想可以试试用4%多聚甲醛固定，15－30分钟。HUVEC是什么细胞？

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做免疫电镜是使用4％多聚甲醛合0.1～0.5％的戊二醛固定的。不知对各位有否启发？
流式和组化没试过

hold住[使用道具]
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发表于 2014-9-1 18:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也做HUVEC培养.你的免疫组化做得怎样了?
用丙酮固定时不能在孔板内固定,把盖片拿出来放到载玻片上再固定,然后树胶粘上.

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