【求助】定点突变求助

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标题:【求助】定点突变求助

bring[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求大神指导！
我要做的是讲质粒进行定点突变，质粒大小为4800 bp，一共用了两对引物进行pcr。酶是NEB的Q5高保真聚合酶，变性温度是98℃，退火温度是53℃，条件都是按照酶的试剂盒上的条件来的。但没有P出来，不知道是引物的问题还是退火温度的问题或者别的什么原因。求大神指导啊！我已经重复好好几遍了。

附件

2014-9-21 15:17

Administrator 2014-03-17 17 ʱ 13 分_看图王.jpg (31.31 KB)

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你如果是要扩增质粒的话需要进行单酶切。定点突变有专门的试剂盒。很好用的

TNT[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

KOD Plus 点突变试剂盒试试

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

需要使用专门的试剂盒吗?自己设计一对引物不就可以了

bring[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 XYZQ 于 2014-9-21 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

需要使用专门的试剂盒吗?自己设计一对引物不就可以了

引物是自己设计的，没用定点突变的试剂盒，只是用了高保真酶

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看镁离子的浓度够不够，要不要特别添加，有时P出来的浓度不够，你也可以转化啊转化之后看看有没有准确的，转化到DMT这种大肠不就可以啦，

ending[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物是自己设计的，没用定点突变的试剂盒，只是用了高保真酶

==========================================================================

我觉得可能是引物或着条件的问题,
1.98度变性?一般不都是94或95度吗?
2.退火温度可以从50-60做一下梯度, 不知道实验室有没有温度梯度PCR仪器,一个八排管可以一次做完。
3.突变点在引物的什么位置？GC含量高不高？
4.可以由后向前找问题。

bring[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得可能是引物或着条件的问题,
1.98度变性?一般不都是94或95度吗?
2.退火温度可以从50-60做一下梯 ...

===========================================================================================================

98度变性是按照酶的说明书的要求来的，Q5高保真酶的变性温度比较高。突变位点在引物的中间位置，GC含量第一对引物为50%，第二对引物为55.56%

bluelake[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

定点突变的效率本来就很低，而且还需要用大肠杆菌自身的修复系统去修复，而且会存在很多问题，在里面，是不是把循环数可以增加一下，因为用酶切之后，就可以把模板的质粒切掉了。我没有感觉用什么酶有什么不同，酶的变性温度和复性的温度是和酶的自身相关的，是要看说明书的。

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-9-21 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

98度变性是按照酶的说明书的要求来的，Q5高保真酶的变性温度比较高。突变位点在引物的中间位置，GC含量第 ...

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直接用安捷伦的点突变试剂盒，引物用你现在用的，很好用，我做了好几个，一次性成功。不过，就是有点小贵吧，10次，4000块。

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