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标题:【求助】5‘RACE二扩弥散

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发表于 2014-9-24 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】5‘RACE二扩弥散

上周二抽的RNA，纯度1.98，模板稀释到100微升的。
做touchdown，
一扩： 模板2  LAtaq 0.1  buffer2  dNTP0.7  引物各3,20微升体系
二扩：pcr产物做梯度稀释：原液、10倍、100倍，500倍，体系中加1微升模板，其余不变。

完了跑胶一片弥散，而且除了原液和10倍稀释以外其他连弥散都没有。

请教各位大,
1、touchdown延伸要求2min，是不是可以调整下，1min可以不？我的5'end预计不会超过1K。
2、是否怀疑模板的问题？用的oligodG接头。有听说做单引物不用接头效果也很好，下次想试试。
3、稀释度或者稀释操作出问题？
4、还是不用touchdown，做一做Tm梯度跑跑引物来做？

谢谢
附二扩电泳图一片


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2014-9-24 11:06
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发表于 2014-9-24 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
重新提了5end的RNA，没做消化，没调浓度（大约2ug左右，纯度1.92）直接RT，今天又跑了一遍，二扩如下图：


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发表于 2014-9-24 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求教：二扩是做了NUP通用巢式单引物做对照，两者都还是拖带，左边是样品，右边是单引物对照，除了引物可能特异性不强，我一扩是没有稀释加1ul直接二扩，是不是模板也比较杂，因为看到单引物对照也是拖带，想求这个的解释。。。程序依旧TD，72度延伸1min，最后一轮29个循环。

附一扩结果，如下图


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发表于 2014-9-24 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是RNA跑的胶，点了3微升：


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3.22 RNA.jpg (36.11 KB)
 
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发表于 2014-9-24 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果预测的待扩序列不超过1Kbp，就没必要用2min的延伸了，1min足够（普通聚合酶的延伸速度在60nt/s以上，高保真酶可能低些），延伸太久、循环数多，对酶活损耗大。

单特异性引物扩增5'？楼主可否提供信息来源？很有兴趣探讨一下，呵呵。

至于用不用touchdown或者touchdown的条件，甚至你要touchup都是可以不断尝试的，RACE看运气吧，有时候不稍半点功夫就成功，也有花了1年多2年的都钓取不出来的。

至于模板，楼主可以用之前扩增中间片段的一个sense primer和现在扩增5'的antisense primer（或其他合适的引物）进行验证。
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发表于 2014-9-24 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我硕士阶段用的cloneteq的smart RACE,我没有用touchdown 不过也用的两轮扩增我的方法很好用~朋友拿这个方法都做出来了，第一轮只扩20个循环，退火温度65， 第二轮用第一轮的模板可稀释也可以不稀释，引物用inner的特异引物，5‘如果试剂盒里有inner的也可以换成inner的，这样两边都增加特异性，扩增30个循环足够了，至于退火温度可以摸索60-68，那个试剂盒要求68度的，延伸按照1min=1kb来算，看目的条带的大小。希望对楼主有帮助!
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发表于 2014-9-24 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢楼上两位！
首先单引物扩不是用oligodG加通用接头的方式得到的专门5'end模板，而是用3'end的模板在PCR时接头再继续扩增。不知道这样说明白吗？只是稍有了解，但不是我实验室的常规做法，所以没深入。

今天重新跑了一下，延伸调到1min，依旧拖带，试了一个比较久之前的没消化直接RT的模板，发现500bp左右有稍明显的带，但是拖带很严重，所以还是失败告终。

我觉得还是模板的质量要求，明天重新手动抽RNA试试看。一切交托给命运，太悲摧了吧～
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 小中大
实验室有LA，PCR仪也还不错，我想touchdown比较简略一点，引物的话已经完全按照touchdown的要求做，Tm拉高，基本也没看到缺陷，如果最终是引物问题，那rp是低到极点。至于跑胶拖带，实在找不到除了模板以外合适的说法，我想不稀释了，提纯下模板，有没有用？或者说，单从PCR的角度看，能否解释拖带的原因？如果重提RNA都出不来，那我没办法了…
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发表于 2014-9-24 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也做RACE，但是我都不懂什么touchdownPCR,一个师兄在林科院，我就用的师兄给我的程序做的，条带是有的，但是回收之后，经过一系列处理，去测序，怎么都不是我自己要的序列，几乎都是载体
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发表于 2014-9-24 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

lz，用td还要摸索条件根本没必要的，做5 race就是要多设计几对引物，然后做nested pcr，因为经常第一轮PCR都没有清晰的带，有这时间去td不如多设计引物～～
另外，race'说明书提供的方法不一定好用，首先mRNA质量要好，其次做nested pcr，成功率还是很高的
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