小中大现在的问题是：目标条带下有非特异性条带出现，并且出现不稳定，一会这个孔有非特异带，一会那个有，时而亮时而不亮，时而有时而没有。
我现在已尝试过的解决办法有：
1.更换试剂：DNA从新分装稀释,MIx换新，从新稀释引物，没解决；
2.降低循环数，以前35，现在32，没解决；
3.请师兄操作一遍，没解决；
4.做梯度pcr，问题是提高退火温度，非特异带开始变亮，特异带逐渐变暗到没有（第一次做梯度PCR时，只有特异带，提高退火由亮变暗，很正常），很困惑；
5.加入5%DMSO，情况如旧。
我现在能想到的问题只有：
我最近做的PCR用的ddH2O，没有灭菌，从新稀释的引物也是用没有灭菌的ddH2O,请问有影响吗？
大家对我的问题有什么看法，恳请慷慨地提出宝贵意见，一起讨论！！！万分感谢
