【求助】荧光定量曲线

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标题:【求助】荧光定量曲线

=菓子=[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教下大家，我这个曲线样品的Ct值已经大于30了，是不是我提取RNA浓度不够？但是RNA浓度测定大都在800ng/ul左右，反转录有问题吗？右边样品的溶解曲线低于0了，这是什么问题？谢谢大家啦，实验被困于此很久了。拜托，拜托各位帮个忙分析下。感激不尽。

附件

2014-9-25 10:26

荧光定量.jpg (71.38 KB)

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

具体啥情况啊，大于30个DT，一般S型的也会判阳性的。

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该不是浓度的问题，有可能是这个基因表达量本来就很低。你用普通PCR扩增过这个基因吗？能扩增出来吗？你可以把熔解曲线贴出来看看引物有没有问题。

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看家基因能在17左右起峰应该不是模板浓度问题,而是你基因表达峰度底,但这完全不影响你检测嘛, 你用你的基因检测引物先做个标准曲线,看在30-40 Ct之间扩增的结果是否真实，如果真实就这样做师妹问题的。不过看你扩增的曲线甚乱，可能原因有几个：1，一般不会出问题的看家基因你也阔的不好，说明要么是你的配定量技术还有待改善，要么就是你的荧光定量试剂很烂；2，你的基因扩增的情况很不好，但也不像扩到的是dimers, 或许是阔增的条件没调对，可以调下退火温度跟延伸时间试试看能否好点，也可以换对引物试试

还有，lz如果想别人帮你分析问题，最好也奖熔解曲线放上来......

=菓子=[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该不是浓度的问题，有可能是这个基因表达量本来就很低。你用普通PCR扩增过这个基因吗？能扩增出来吗？你可 ...

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但是我换成同一植物其它组织的样品后，CT值就在25左右。引物溶解曲线正常。普通PCR没做过。

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发表于 2014-9-25 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看家基因能在17左右起峰应该不是模板浓度问题,而是你基因表达峰度底,但这完全不影响你检测嘛, 你用你的基因 ...

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我的预混液是去年买的了，估计有点问题。加个你的QQ嘛，我觉得那你可以帮我解决很多试验问题。

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能你保存试剂保存得不好。我这冰箱从来都没断过电基本1年多了试剂效力还是足的。我这里经常做实时荧光RT-pcr实验，从来都是用takara的一步法试剂盒，一个试剂盒就只能做一个星期效果都是非常好的。叫你老板在你做实验前的一两个星期才给你买效果会好很多的。Takara 虽然是鬼子的，起码我们这用了好几年都是很稳定的。酶活力还很足，因为从生产到出货到你手中时间是所有试剂盒中最短的。

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-9-25 10:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

z你想提高灵敏度建议你做个Taqman 定量会好很多

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发表于 2014-9-25 10:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yhz1973 于 2014-9-25 10:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
z你想提高灵敏度建议你做个Taqman 定量会好很多

我发现了最大的问题，就是SYBR过期了，现在我按照你的提议准备做下一次试验。我是2013年9月份提的RNA，我买的天根的反转录酶试剂，现在我想重新做反转录，请问下，我还需要测定RNA浓度不？或者我稍微提高点加样量。提出来的RNA都保存在-80℃的超低温冰箱里。