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标题:【求助】荧光定量PCR阴性对照峰值和样品一样

简森si[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR阴性对照峰值和样品一样

是荧光定量pcr的图，加粗的是阴性对照，SYB染料、水和引物。第一张图峰值和我的样品差不多，确定没有加CDNA。我的CDNA样品也跑了很多基因了，没遇到这样的情况，请教一下各位前辈，肿么回事啊？
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发表于 2014-9-25 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 简森si 的帖子

很明显是污染了检测基因的模板，有可能是你的cDNA模板，也有可能是之前的PCR产物。
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很明显,引物污染了模板....  对了，请问你的用的可是天根的sybr1 mix 试剂？？
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简森si[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 eric930 于 2014-9-25 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很明显,引物污染了模板....  对了，请问你的用的可是天根的sybr1 mix 试剂？？

TAKARA
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简森si[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 eric930 于 2014-9-25 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很明显,引物污染了模板....  对了，请问你的用的可是天根的sybr1 mix 试剂？？

我确定我阴性对照加的是水。
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 简森si 于 2014-9-25 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我确定我阴性对照加的是水。

没错,你用水代替了模板,但是你的引物污染进了模板嘛... 这样你模板用水也没用是吧?
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简森si[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 eric930 于 2014-9-25 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


没错,你用水代替了模板,但是你的引物污染进了模板嘛... 这样你模板用水也没用是吧?

那我换一组八联管？
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 简森si 于 2014-9-25 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


那我换一组八联管？

额...... 是换没被污染的引物..... 如果还有引物干粉，那就重新用干净的水去溶。。。。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以将试验完的体系跑个2%的琼脂糖凝胶看看嘛，看有无条带。另外，扩增曲线中我认为阴性对照所在的位置也算正常，因为到达阈值的ct值已经到了35左右了，可以忽略了。融解曲线中阴性对照在左边，说明即算有产物条带大小也小于其它样本产物，不知道是不是引物二聚体。
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wiwi[使用道具]
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发表于 2014-9-25 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我来回复楼上所有人的疑问：  对于一个每天都要做几十管PCR和众多的不同基因的人。到目前为止我估计做了至少5w管各种PCR反应的经验来说。  用sybr green  1   来做定量PCR总是空白对照阴性对照会在35左右翘尾巴，是正常现象。sybr green 1 最总要的是看溶解曲线。所有我不建议做用染料来做的定量。要定量最好还是用taqman法。  所有做阴性对照和空白对照的电泳结果都是在100bp以下会出现淡淡或者很亮的条带都是正常，这是引物2聚体和一些非特异性扩增的片段。这就解释了sybr green 1为什么空白最后会有翘尾巴。
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