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标题:【讨论帖】PCR问题交流

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发表于 2014-9-25 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】PCR问题交流


各位站友，多日以前，曾遇到一位朋友，让我来这和大家交流交流一些分子生物学的经验，一时太忙，落下了，今日在这开一贴，欢迎大家交流
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baidukk[使用道具]
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发表于 2014-9-25 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知群里是否有做多重PCR的兄弟姐妹，在这里想请教一下下面的多重PCR程序是如何设计出来的，需要依据什么来设计？请高人指点。
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（95℃           45s  
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发表于 2014-9-25 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下聚合酶延伸效率的问题。一般的聚合酶的延伸效率是多少？在做pcr的时候，为什么20s就可以扩增出2K的片段？很迷惑。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-9-25 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何pcr新基因？
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发表于 2014-9-25 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 2541 于 2014-9-25 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想请教一下聚合酶延伸效率的问题。一般的聚合酶的延伸效率是多少？在做pcr的时候，为什么20s就可以扩增出2K的片段？很迷惑。

一般的来讲，Taq聚合酶的延伸速度是1000bp/min
至于你说在20s延伸出2000的片段这个有可能，但并不常见
一般在非特异扩增或者以逆转录产物做模板的时候会出现。
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发表于 2014-9-25 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 redbutterfly 于 2014-9-25 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如何pcr新基因？

你是指吊取未知基因是吗，这样的话，一般是根据这个未知基因在不同物种间的同源性在保守区设计同源简并引物进行PCR如果要获得全长基因的话还可能要在两端进行RACE扩增获得5'端和3'端非编码序列。
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发表于 2014-9-25 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下：
我的目的片段是DNA长度5700多，CDNA长度1900，起初想从DNA中扩增目的条带，但是一直没有扩增出来，因此我提取RNA，合成CDNA第一链，这回有条带了，但是条带很弱，我的PCR条件：
1.  94°  3min
2.  94°  30sec
3.  51° 1min
     -0.1°每个循环
5.  72° 3min
6.   2 ~5 32个循环
7.   72° 10min
我想进行胶回收然后，然后克隆该基因，不知道该如何优化a
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发表于 2014-9-25 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先谢谢楼主，不过我扩出来的是目的条带，没有非特异条带。我正常情况下都按这个效率进行PCR的。
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发表于 2014-9-25 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的目的片段是DNA长度5700多，CDNA长度1900，起初想从DNA中扩增目的条带，但是一直没有扩增出来，因此我提取RNA，合成CDNA第一链，这回有条带了，但是条带很弱，我的PCR条件：
1.  94°  3min
2. ...

================================

CDNA1900?另外你是用的长距离taq酶么？
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 小中大
长的和普通的都用了！
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