【求助】有关Taq聚合酶和Pfu高保真酶

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标题:【求助】有关Taq聚合酶和Pfu高保真酶

yonger[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这两个酶的延伸速度分别是多少呢？
我用这两个酶进行相同体系的pcr反应，结果Taq酶可以P出来，而Pfu却没有条带，我目的片段大小是3000bp，我当时没有注意到这两个酶延伸速度的不同，采用了3分钟的延伸时间一起进行，是不是这个原因导致Pfu没有P出来呢？貌似Pfu的延伸速度比Taq慢，但是我也不知道确切的，在此向各位请教一下

yonger[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自己查了下，Pfu延伸速度大概为600bp/min，有的公司产品推荐2min/kb，等我再P一次，看看结果如何，到时候和大家一起交流

vera+[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

按照你提供的这个速度来看的话，你的延伸时间是严重不足呢，呵呵，也跟你学到一招了。

yonger[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我又用Pfu扩1200和900左右的片段，和以上相同的模板，延长延伸时间并且做的是梯度，之后仍然没有条带，不知道是不是酶量少了，或者就是引物自身的问题了，忙活来忙活去，着实郁闷啊，我师妹也用的Pfu，片段1000左右，扩增就没什么问题，难道我的模板结构比较复杂吗？谁来帮我啊。。。。。

wood533[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我再定点突变，我听我博士师姐说PFU扩增效率不高，并且我实验室一哥哥用PFU没有扩出来，用Taq min扩出来了。我师姐建议我用Primer star，她说效果还不错。

H2O[使用道具]
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发表于 2014-9-26 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PFU有致命的敏感性低下问题，你的情况很正常，另外，一般的话，酶速度都是1KB/min，最后再加30sec，更准确。

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发表于 2014-9-26 18:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我再定点突变，我听我博士师姐说PFU扩增效率不高，并且我实验室一哥哥用PFU没有扩出来，用Taq min扩出来了。 ...

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定点突变用pcr法的确是非常巧妙的方法。但是我这就偷懒了，直接产物测序，因为测序实在太过于方便人也懒了。而且测序成本也低了很多。