PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PCR产物电泳出现比目的条带大900bp的片段

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】PCR产物电泳出现比目的条带大900bp的片段

bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
1

发表于 2014-10-7 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物电泳出现比目的条带大900bp的片段

最近用primer5.0和oligo7.0设计了两个基因的引物，NCBI blast结果如图，目的片段都是200左右。普通pcr产物电泳结果，一个电泳图的条带在1000bp左右，没有出现目的条带。另外一个是普通pcr产物电泳，目的条带很淡，在1000左右也出现了一条很亮的条带，请大神帮忙分析，非常着急，等着做后面的RT实时定量PCR


查看积分策略说明
附件
2014-10-7 09:35
QQͼƬ20131228220029.jpg (51.43 KB)
 
顶部
yueban-1147[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75776
精华 0
积分 692
帖子 1064
信誉分 100
可用分 6113
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
2

发表于 2014-10-7 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物序列总得贴一下吧。。
电泳图也弄来看看。。
这个blast的是测序结果还是目的基因直接弄的啊
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
3

发表于 2014-10-7 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物序列总得贴一下吧。。
电泳图也弄来看看。。
这个blast的是测序结果还是目的基因直接弄的啊

==================================================================

引物序列为
上游5‘ TATCCCAAGACCTGGAGCAC’3
下游5‘TTGTAATAGCGATCCCTGGC’3
blast是目的基因直接弄的，还没有测序，我想都没有必要测序。电泳中1是其中一个因子的


查看积分策略说明
附件
2014-10-7 09:42
2013.jpg (16.79 KB)
 
2014-10-7 09:42
2013.jpg (16.79 KB)
 
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
4

发表于 2014-10-7 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物序列总得贴一下吧。。
电泳图也弄来看看。。
这个blast的是测序结果还是目的基因直接弄的啊

===================

我是直接用引物blast的图
顶部
uaubc[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107981
精华 0
积分 451
帖子 562
信誉分 100
可用分 3661
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
5

发表于 2014-10-7 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两个引物的GC分布不是很好。一般要求5端或中部有较高GC，而3端GC较低。如果3端较高会有杂带危险。
下游引物的二聚体中3端粘着了，不是很好。
6碱基出现频率分析中两个引物都非常好。
退火温度也还行。

总的来说引物应该可以用。
应该是pcr程序的问题了，有空贴来看看。
PCR程序延伸时间改20秒。你用的是一分钟么？？
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
6

发表于 2014-10-7 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 uaubc 于 2014-10-7 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个引物的GC分布不是很好。一般要求5端或中部有较高GC，而3端GC较低。如果3端较高会有杂带危险。
下游引物的二聚体中3端粘着了，不是很好。
6碱基出现频率分析中两个引物都非常好。
退火温度也还行。

总的来说引物应该 ...

我程序是 94℃    4min
             94℃    15s
             59℃    30s
             72℃   30s
             72℃    8min
第二步到第四步重复35个循环
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
7

发表于 2014-10-7 09:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 uaubc 于 2014-10-7 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个引物的GC分布不是很好。一般要求5端或中部有较高GC，而3端GC较低。如果3端较高会有杂带危险。
下游引物的二聚体中3端粘着了，不是很好。
6碱基出现频率分析中两个引物都非常好。
退火温度也还行。

总的来说引物应该 ...

但是出现一千多的条带很是费解？
顶部
dodoit[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114479
精华 1
积分 340
帖子 377
信誉分 101
可用分 2624
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
8

发表于 2014-10-7 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bongte 于 2014-10-7 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


但是出现一千多的条带很是费解？

taq酶的延伸速度大约是2000bp/min, 所以延伸30s出现1000bp以上的条带并不奇怪。如果模板、体系和PCR程序没有问题的话，就一定是引物不合适了。引物的特异性差会导致杂带出现，但一般目的条带也会得到扩增，从你的电泳图中无法确认第二条泳道出现的是否是目的条带（可能是引物二聚体）。所以建议：重新设计引物，增加引物长度（24~27bp），长度增加，适当提高退火温度，引物特异性会增加。至于设计引物的其他标准，用primer5基本可以搞定。祝你好运！
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
9

发表于 2014-10-7 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dodoit 于 2014-10-7 09:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


taq酶的延伸速度大约是2000bp/min, 所以延伸30s出现1000bp以上的条带并不奇怪。如果模板、体系和PCR程序没有问题的话，就一定是引物不合适了。引物的特异性差会导致杂带出现，但一般目的条带也会得到扩增，从你的电泳图 ...

准备重新设计引物了，谢谢
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
10

发表于 2014-10-7 09:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
都不明白你说的啥？电泳那不是有条带吗？还有啥问题呢？
顶部