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标题:【求助】关于pcr条带不亮的问题

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于pcr条带不亮的问题

pcr条带不亮，做了好多次了，纠结。求大神指点...
用cDNA为模板，P出目的片段，不亮。然后用P出的目的片段为模板，0.5ul，P出的条带还是不亮，貌似出现严重的引物二聚体。要做切胶回收。
两种模板都做过梯度，还是不亮！增加了到35循环，不亮！
反应条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
45℃-59℃ 30s（梯度）
72℃ 1.5min
72℃ 10min
4℃ 1h
25ul体系
求大神指点...
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发表于 2014-10-7 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一次PCR产物浓度底无需回收。。直接当模版就可以了
第一次PCR没有二聚体。。二次有二聚体。。。
二次有改变温度？。。。。。
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 小中大


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原帖由 u76mp 于 2014-10-7 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次PCR产物浓度底无需回收。。直接当模版就可以了
第一次PCR没有二聚体。。二次有二聚体。。。
二次有改变温度？。。。。。

第一次的没回收，    第二次以第一次的pcr产物为模板，还是用第一次的梯度P的，结果二次扩增有引物二聚体
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发表于 2014-10-7 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ilovegaga 于 2014-10-7 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


第一次的没回收，    第二次以第一次的pcr产物为模板，还是用第一次的梯度P的，结果二次扩增有引物二聚体

第一图是第一次梯度？？为啥就3个样？？
你第一次用梯度P。。第二次就不需要了。。。根据梯度结果。。你应该可以确定哪个温度。。。。
引物多少uM??
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
试看看
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发表于 2014-10-7 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


第一图是第一次梯度？？为啥就3个样？？
你第一次用梯度P。。第二次就不需要了。。。根据梯度结果。。你应该可以确定哪个温度。。。。
引物多少uM??
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
试看看 ...

第一的梯度P出来，但是不亮。
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发表于 2014-10-7 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


第一图是第一次梯度？？为啥就3个样？？
你第一次用梯度P。。第二次就不需要了。。。根据梯度结果。。你应该可以确定哪个温度。。。。
引物多少uM??
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
试看看 ...

20uM
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 小中大


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原帖由 ilovegaga 于 2014-10-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


20uM

第一次PCr
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
检测结果确定温度
二次PCr
用30ul体系
引物10uM
如果回收浓度要高就P俩个一起回收
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 小中大


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原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


第一次PCr
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
检测结果确定温度
二次PCr
用30ul体系
引物10uM
如果回收浓度要高就P俩个一起回收


第一次pcr以cDNA为模板的。现在木有cDNA了。
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发表于 2014-10-7 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
梯度也做过了啊 45-59℃的，帖子有图啊，引物二聚体严重是引物浓度太高了吗？

但是以cDNA为模板扩增时没引物二聚体啊？为什么以cDNA模板扩增出来的管液  为模板时，引物二聚体这么严重呢？
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feima+[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ilovegaga 于 2014-10-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


第一次pcr以cDNA为模板的。现在木有cDNA了。


_ _！你。。。。
你PCR体系是按标准加的么？？
我一次cDNA可以P很多次
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