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标题:【求助】实验设计请教

松子儿[使用道具]
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【求助】实验设计请教

实验设计问题:请大家解答,谢谢!我现在要验证一种寄生虫分泌蛋白的功能,其与丝氨酸蛋白酶有同源性,这种蛋白酶与消化,组织再造,凝血,凋亡有关, 但我们不能确定寄生虫的这种蛋白酶的功能,因此我通个构建载体,将其转入细胞,看他对凋亡,细胞周期等有没有影响,结果表明没有变化,现在想通过对转染的细胞进行免疫共沉淀,来检测与其相互作用的蛋白,从而来推测其功能,不知技术路线上有没有问题,另外想请大家推荐些方法来检查其功能,谢谢.
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huifeng0516[使用道具]
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既然是分泌性蛋白,很可能它是作用于其它靶细胞,而不是分泌此蛋白的细胞,利用转染细胞进行免疫共沉淀可能得不到结果。既然转染没有确定它的功能,不知道你能否通过敲除或沉默这个基因来看看。
对于你的问题我还是不太清楚,譬如这种寄生虫能否在模式动物上生长,这个基因被转染到了那一类细胞上。
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回复 #2 huifeng0516 的帖子

首先十分的感谢您的解答,不好意思我没有表达清楚,这种寄生虫寄生在老鼠或人的肌肉细胞,我所研究的是寄生虫分泌的蛋白,免疫组化他定位在肌细胞的细胞核上,因此推测他调控细胞的表达,使其易于寄生在肌肉细胞内。所以我将他转染到肌细胞,来看他对细胞的凋亡,再生,细胞周期的影响,但现在没有任何变化,另外转染的蛋白不像在原位,他没有定位到细胞核,不知是不是和机体环境有关,所以我想做免疫沉淀,来观察其与肌细胞的相互作用蛋白,不知另外还有什么方法,谢谢。
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huifeng0516[使用道具]
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我觉得你做免疫共沉淀可能不会有结果。理由如下:
1.你转染得到的蛋白和寄生虫自然分泌的是不一样的。因为这个蛋白是寄生虫的外分泌蛋白,所以它有必然有一段定位到内质网上合成的信号序列(信号肽),需要在寄生虫细胞的内质网和高尔基体上进行糖基化修饰,完成折叠后,由高尔基体形成分泌小泡,释放到线虫细胞外。由于寄生虫的内质网输入信号序列不能被寄主的肌肉细胞所识别,所以你转染肌肉细胞得到的蛋白,实际上是在肌肉细胞的细胞质中合成的,比寄生虫自然分泌的多一段信号肽,并且缺乏必须的糖基化修饰。
2.因为缺乏必须的糖基化修饰,你人工表达的这个蛋白将不能正常折叠,并且因为缺乏有关糖链,它不能被其它相互作用的蛋白所识别,导致不能发挥它应有的生物学功能。
3.因为这个蛋白是一个定位于肌肉细胞核的蛋白,它还应该有一个核定位信号序列,通常核定位信号都是线性表位的,也就是说存在于蛋白质的一级线性序列中,但也有的是空间表位的(信号斑),你这个蛋白的核定位信号很可能就是空间表位的,因为你人工表达的蛋白不能正常折叠,所以没有形成核定位的信号斑,不能被定位到细胞核中。
我建议你这样开展实验:
1.在寄生虫中过表达或沉默这个基因,看看它对寄生虫和肌肉细胞有什么影响。
2.如果上述实验做不到,是否考虑培养寄生虫的分泌这种蛋白的细胞,然后进行敲入实验,导致过表达,来观察它对肌肉细胞的影响。
3.以前做过的工作可以通过对自然分泌蛋白和人工表达蛋白的测序比较来研究信号肽,这应该也能写篇像样的文章。
4.研究此类蛋白质功能时,一定要考虑表观遗传修饰的影响。
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十分感谢您的帮助,我会按照您的建议来改进我的实验, 另外,目前我正将在我的目的基因前加入一段和定位信号,再来看他对肌细胞的影响,并通过在感染动物的肌细胞中,来进行免疫沉淀来确定相互作用的蛋白,不知这样做是否可行,再此感谢您的帮助,谢谢。
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huifeng0516[使用道具]
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我也考虑过是否融合一段核定位信号,但是感觉到这个蛋白的高级结构可能很重要,表达蛋白之所以没有被转运到细胞核,很可能就是因为它没有正确折叠,导致核定位信号异常。尽管人工加了经典的线性核定位信号后(如Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly),它很容易被转运到细胞核,但是能否发挥生物作用,则难以肯定,这样可能得不到免疫共沉淀实验的结果,即使得到了,这个结果在发表文章时容易受到编辑质疑。所以即使你要这样做,也最好作为你发表文章是的旁证,而不是主要证据。
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十分感谢您,谢谢您每次的指导,提出非常好的建议。我用软件预测了蛋白序列,结果显示其没有核定位序列,是否软件预测的和蛋白本身会有差别,谢谢您,那么我就先看一下是否定位到核上会对细胞有影响,然后结合在感染的肌细胞原位的免疫共沉淀来共同验证试验结果,不知是否可行,谢谢您,对我的打扰表示道歉。
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huifeng,您好,我看文献报道许多丝氨酸蛋白酶如凝血因子在真核细胞中表达会分泌到细胞外,是否我现在分析的丝氨酸蛋白酶也会分泌到细胞外,因为他是一只分泌蛋白,不知道表达的外源性蛋白分泌到细胞外的条件是什么谢谢!
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不好意思又打扰您了,我想请教您,我现在的这个蛋白酶是以酶原的型式存在,我要在细胞内表达的蛋白酶,不知道他的成熟酶的劈裂位点怎么分析,应该去掉多少个氨基酸残基,可以变为有活性的酶,我想是否这样可以发挥蛋白功能,谢谢。
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松子儿[使用道具]
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不好意思,再次打扰您,我做的是一种胰蛋白样丝氨酸蛋白酶,现在在表达到细胞但对细胞没有影响,是否是由于表达的蛋白没有活性,所以我想检测一下蛋白是否有丝氨酸蛋白酶活性,但由与表达载体上只有绿色荧光蛋白融合表达,不能够进行纯化,不知道可以通过提取细胞总蛋白,然后进行酶活性分析,不知道有什么方法来测表达蛋白的酶活性,对您的帮助表示感谢,谢谢您每次提出好的建议。
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