小中大1、原理: 在细胞培养过程中,加入一定是的5-溴脱氧尿苷(BudR ),当细胞在DNA复制过程时,BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此,当细胞处于第二个分裂周期时,同一染色体的两条姐妹染色单体,一条由双股都含有BudR的DNA链构成,而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低,故对染色剂亲合力低,在用Giemsa染色时其单体着色浅,只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。 2、BudR贮存液的配制: BudR 5mg(先用0.5ml 1N NaOH溶解) 然后加蒸馏水至 5ml 即成1000ug/ml的贮存液,因BudR遇光会发生分解,贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。 3、实验材料: 所检培养细胞; BudR贮存液; 2×SSC液; 常规染色体制片所需物品; 水浴锅; 20W紫外灯一个; 培养皿; 镜头纸; 4、操作程序 (1)BudR掺入:细胞培养24小时后于培养液中加入BudR,最终浓度5-15mg/ml,避光条件下继续培养。 (2)终止培养:待细胞经历两个细胞周期(48小时),培养终止前3小时加秋水仙素,秋水仙素终浓度为0.02ug/ml培养液; (3)常规制片及烤片; (4)紫外灯照射:取标本玻片置于大号培养皿内,正面朝上,上覆盖镜头纸,从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿,移入50-60℃水浴锅内,紫外线灯距离5cm,照射30-40分钟; (5)染色:取出照射后标本,蒸馏水冲洗,置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟; (6)洗片及存片:同G带片 注意:BudR是一种强突变剂,使用浓度不宜过高,否则会产生细胞毒性作用。 (三)染色体脆性部位(fra) 脆性位点也称危性部位,是在一定的培养条件下人类染色体上某些特异位点非随机地表现出的裂隙和断裂。脆性部位分为普通型和罕见型两大类。 1、实验材料 (1)常规外周血所用物品。 (2)培养基是用不含叶酸的MEM-Fra培养基或低叶酸的CT199培养基。 2、培养液配制 MEM-Fra 90-95% 小牛血清 5-10% 双抗 100u/ml PH调至7.5左右 3、操作程序 与制备外周血的染色体方法相同。 注:脆性X综合症:(FraX) 这种染色体改变是在1969年被发现,1977年被定位于Xq27、记录为fra(X)(q),并命名为脆性部位。X连锁智力低下(MR)与fra(X)(q27)密切相关。FraX的发生率占新生儿的1/2500;占X连锁MR病1/2-1/3;占男性MR的1-2%;其发生率仅次于先天愚型。