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标题:【求助】为啥连接了4次 菌落PCR结果都是这样，究竟是哪...

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发表于 2014-10-26 20:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为啥连接了4次 菌落PCR结果都是这样，究竟是哪...

大连宝生物pmd18-t   连接30分钟 三个小时 和过夜都试过  用公司的感受态菌斑长得很多 密密麻麻的  ，引物用M13-47，48  目的片段大小为1800bp ,为啥连接了4次 菌落pcr结果都是这样啊


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2014-10-26 20:25
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发表于 2014-10-26 20:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能的原因：污染、引物问题、PCR问题（体系、程序出问题等）、感受态失效、未连接上。要一个一个的分析。不要急，细节决定成败。
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-10-26 20:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

T-载体现在不好用，而且比较麻烦
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发表于 2014-10-26 20:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么感觉都是引物二聚体呢 是没连接上么 原因很多 希望你能顺利解决
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INK[使用道具]
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发表于 2014-10-26 20:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 free 于 2014-10-26 20:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

怎么感觉都是引物二聚体呢 是没连接上么 原因很多 希望你能顺利解决

我开始也认为是引物二聚体 我同学说是我没连进去 引物皮 的是载体的两边
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发表于 2014-10-26 20:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先确定你引物和pcr体系有没有问题，做一下阳性和阴性对照，另外建议换一批感受态试试
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发表于 2014-10-26 20:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你连接时的温度是多高呢
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-10-26 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在室温连接效果好一些，高GC含量的也可以试试
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-10-26 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
和我之前遇到的情况基本一样，和我的目的片段长度和载体也一样；按说明书连接和转化，我涂板用的是LB，抗生素很重要，浓度是100微克/毫升，有筛选作用，多数大肠杆菌都会被杀死。转化后摇菌一小时，看到明显浑浊后即可涂板，我是稀释5倍后用用100微升涂板，37度培养12小时左右（不要培养太长时间，会有很多卫星菌落），运气好的话会有十几个菌落，然后菌落PCR，和普通PCR一样，没有特殊之处。没有的话重新涂板，适当减少稀释倍数，加大涂板量。good luck to you!
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发表于 2014-10-26 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果连接成功了，条带会很亮，我连的954bp,最左边一个是阳性对照，其他都是挑选的模板菌落。测序结果很好。


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2012.11.20 菌落pcr.jpg (28.73 KB)
 
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